李曉巖 ，武 運，王犁燁 ，蘇 敏，沈慧慧，巴哈提古麗·馬那提拜

(1.新疆出入境檢驗檢疫局技術中心，烏魯木齊 830063；2. 新疆農業(yè)大學，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆冷水魚肉質鮮美、口感獨特、有較高的營養(yǎng)價值，是新疆特有魚種之一，有良好的市場前景，在南北疆各地區(qū)已形成一定的養(yǎng)殖規(guī)模[1,2]。由于冷水魚幼魚感染疫病的幾率比較高，常給冷水魚養(yǎng)殖造成極大的損失，為了防止這類情況發(fā)生，養(yǎng)殖者曾用孔雀石綠(MG)來對各種魚類和水產品進行殺菌、消毒、凈化水質以及保鮮[3]。MG又稱堿性綠、苯胺綠，屬于合成三苯甲烷類化工染料的一種，具有高效廣譜的殺菌作用[4,5]，在其進入人體后會代謝產生隱色孔雀石綠(LMG)，二者都具有高殘留等毒性[6-10]。國際上將MG以及LMG列為水產養(yǎng)殖禁用藥物[11]。2002年我國農業(yè)部也將其列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中[12,13]，是我國主要打擊的濫用食品添加劑和違法添加非食用物質之一。但由于孔雀石綠(MG)具有明顯的殺真菌作用，違禁使用孔雀石綠(MG)的現象時有發(fā)生，加大對冷水魚等水產品的安全抽樣檢測力度，是重要的手段，但由于我國魚肉中MG及其LMG代謝物殘留量的檢測分析方法存在操作方法繁瑣，耗時長且成本較高等，建立一種高效、簡便、準確、耐用、低成本的檢測方法，是十分必要的?！厩叭搜芯窟M展】我國魚肉中MG及其LMG代謝物殘留量的檢測分析方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[14]、高效液相色譜法-質譜法(LC-MS)[15]、氣相色譜法-質譜法(GC-MS)[16]、酶聯免疫法(ELISA)[17]、表面增強拉曼光譜法[18]?！颈狙芯壳腥朦c】GB/T19857-2005、GB/T 20361-2006 等均能測定孔雀石綠(MG)及其代謝物。但HPLC和ELISA無法提供目標化合物結構信息，GB/T19857-2005和GB/T 20361-2006中前處理操作過程耗時較長，而且目標化合物具有不穩(wěn)定性需要迅速處理并進行上機測定?！緮M解決的關鍵問題】通過優(yōu)化樣品預處理方法和檢測條件，有效校正預處理過程中的誤差和損失，簡化操作步驟，降低成本，并采用內標法提高回收率，建立一種更為高效、準確、低成本的檢測方法,進一步完善新技術標準。

1 材料與方法

1.1 材 料

ACQUITY UPLC-Quattro premierXETM質譜聯用儀(美國Waters公司)；VORTEX-5漩渦混合器(華利達實驗設備有限公司)；腕式振蕩器(美國BURRELL公司)；固相萃取裝置(美國Agilent 公司)；氮吹儀(美國Organomation 公司)；高速離心機(日本HITACHI公司)；Bond Elut-SCX(強陽離子交換)固相萃取柱(500 mg/3 mL)(美國Agilent公司)；DIKMA ProElut C18 (500 mg/6mL)(北京迪馬科技有限公司)；Oasis HLB (500 mg/6mL)(美國Waters公司)；0.2 μm再生纖維素濾膜(美國Waters公司)。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠(D5-MG)、氘代隱色孔雀石綠(D6-L MG)標準品(美國Dr公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，Fisher 公司)；冰乙酸、無水硫酸鈉(Na2SO4)、氨基(NH2)吸附劑、氨水、乙酸銨、98%甲酸：(優(yōu)級純，天津市致遠化學試劑有限公司)。實驗用水均為高純水。

1.2 方 法

1.2.1 標準工作液的配制

用乙腈溶液將MG、LMG及D5-MG、D6-L MG標準品配制成濃度為100 mg/L的標準儲備液，并根據需要用甲醇-水(2:8，v/v)溶液稀釋成適當濃度的混合標準工作液，存儲于棕色瓶中，4℃保存，有效期3個月。

1.2.2 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫35℃，樣品室溫度7℃；流量0.25 mL/min，進樣量10 μL，流動相：A溶液為10 Mmol/L乙酸銨[含0.1%(體積分數)甲酸，B溶液為乙腈；MG和LMG藥物梯度洗脫程序：0～2 min，A由60%～10%；2～5 min 10%保持3 min。5～5.5 min10%～60%；5.5 min～7.5 min 60%～60%。

1.2.3 質譜條件

表1 多反應監(jiān)測掃描模式質譜參數
Table 1 Multi-reaction monitoring scan mode mass spectrometry parameters

化合物Compound母離子Parention(m/z)子離子Daughterions(m/z)錐孔電壓Conevoltage(U/V)碰撞能量Collisionenergy(E/eV)孔雀石綠(MG)329.1207.7?,312.83535,35隱色孔雀石綠(LMG)331.1239.0?,315.83530,20氘代孔雀石綠(D5-MG)334.1317.93535氘代隱色孔雀石綠(D6-LMG)337.0240.03530

注：*為定量離子

Note:*is a quantitative ion

1.2.4 樣品前處理

將去骨的魚肉樣品，用刀式研磨均質儀2 500 r/min粉碎至漿狀

稱取5.00 g試樣，置于50 mL離心管中，加入適當的內標溶液和標準溶液，移取15 mL 1%冰乙酸-乙腈溶液，振蕩20 min，加入6 g無水硫酸鈉，渦旋1 min，4 500 r/min離心10 min，放置20 min。

1.2.5 初凈化

量取7.5 mL上清液至15 mL離心管中，加入400 mg NH2，渦旋2 min，4 500 r/min離心10 min。

1.2.6 SCX 固相萃取柱凈化

準確移取1.2.5中上清液6 mL于15 mL試管中，加入0.3 mL甲酸混合，為待凈化液。SCX固相萃取柱凈化：用2.5 mL乙腈-甲酸溶液(98：2)平衡活化。將待凈化液轉移至小柱中，用2.5 mL乙腈溶液沖洗試管，轉移至小柱中，依次用2.5 mL丙酮溶液、2.5 mL甲醇溶液、2.5 mL乙腈溶液洗滌，將10 mL刻度試管置于固相萃取柱下，用7.5 mL氨水-乙腈(6：94)溶液洗脫，接收洗脫液。在氮氣下45℃緩緩吹干，用400 μL甲醇-水(2：8，v/v)溶解殘渣，渦旋振蕩30 s，用0.2 μm再生纖維素濾膜過濾至1 mL全回收樣品瓶中，供UPLC-MS/MS測定。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的選擇和優(yōu)化

魚肉中富含蛋白質、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，脂肪含量相對較少。乙腈能夠使蛋白質變性沉淀，離心后去除；Na2SO4能吸收基質中的水分；NH2作為吸附劑能吸附基質提取液中部分脂肪和碳水化合物。用純乙腈作為提取液，待測物的峰形不對稱，靈敏度低，而在乙腈溶液中加入一定量冰乙酸后，待測物的峰形較好和靈敏度較高。由于MG和LMG在酸性環(huán)境下能夠以一種穩(wěn)定狀態(tài)存在，分別選擇濃度為0.3%、0.5%、1%的冰乙酸-乙腈溶液進行試驗。試驗表明，1%的冰乙酸-乙腈提取液使目標化合物的峰形和靈敏度最好。

2.2 固相萃取柱的選擇

分別對DIKMA ProElut C18 500 mg/6 mL、Agilent BOND ELUT-SCX 500 mg/3 mL、Oasis HLB 500 mg/6 mL三種固相萃取柱進行了選擇。試驗表明，SCX 500 mg/3 mL固相萃取柱能夠較好的保留目標化合物，并能夠使樣品中的雜質與目標化合物完全分離，能夠準確定量，滿足回收率的要求。

2.3 色譜條件的選擇和優(yōu)化

實驗比較了Acquity BEH C18 (2.1 mm×50 mm.1.7 μm)、ODS C18 Hypersil 5 μm，250 mm × 4 mm色譜柱的分離情況，前者對MG和LMG能完全分離,保留時間具有較好的穩(wěn)定性，對實際樣品檢測適用性更好，同時色譜圖基線分離，色譜峰型對稱，雜峰干擾少。MG、LMG的保留時間分別為1.58 min、3.02 min。圖1

2.3.1 流動相的選擇

目標化合物的測定是采用正離子模式，用極性色譜柱C18來分離，通常使用乙腈溶液和甲醇溶液作為有機相，乙酸銨或甲酸銨、乙酸或甲酸溶液作為水相。研究發(fā)現，當使用10 mmol/L乙酸銨[含0.1%(體積分數)甲酸]溶液和乙腈溶液作為流動相時，待測物的靈敏度和峰形都比較好。選擇流動相10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)溶液為A，乙腈溶液為B。

2.4 質譜條件的優(yōu)化

分別用0.5 mg/LMG、LMG的單一標準溶液進樣，通過ESI()模式進行一級質譜全掃描，能夠得到每種目標化合物的母離子，再對其子離子進行全掃描，以MRM模式進行檢測分析。通過調節(jié)錐孔電壓和碰撞能量，使其特征離子響應值達到最高，最終確定每種目標化合物的質譜檢測參數。表1

2.5 定性及定量

對樣品目標化合物進行檢測時，如果樣品中化合物質量色譜峰的保留時間與標準溶液的保留時間一致(變化范圍為±2.5%之內)；檢測到樣品質譜圖中所選擇的離子均出現，同時所選擇的離子豐度比與標準溶液中的離子豐度比一致，最大允許相對偏差不得超過文獻[19]中規(guī)定的范圍，可以確定樣品中存在目標化合物，采用內標法定量。

2.6 線性關系及檢出限

分別移取適量的MG、LMG及內標物標準工作溶液，配制成目標含量為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的標準曲線，其中內標物含量為20 μg/L，上機測定。以目標化合物峰面積對內標物峰面積之比為縱坐標Y，以目標化合物相應的添加含量(μg/kg)的峰面積對內標物峰面積之比為橫坐標X，兩者呈線性關系。

圖1 MG及D5-MG和LMG及D6-MG標準溶液譜圖
Fig. 1 MG and D5-MG,LMG and D6-MG standard solution spectra

檢出限(LOD)為特征離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3，定量限(LOQ)為(S/N)大于10，得到MG、LMG的LOD為0.6 μg/kg，LOQ為2.0 μg/kg。表2

表2 孔雀石綠及隱色孔雀石綠線性范圍、線性方程、相關系數
Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient of malachite green and leuco malachite green

化合物Compound線性范圍Linearrange(μg/L)線性方程Linearequation相關系數Correlationcoefficient(r2)孔雀石綠(MG)5.0～100.0Y=2.76231X+0.2410270.9997隱色孔雀石綠(LMG)5.0～100.0Y=0.75473X+0.9260830.9992

2.7 回收率與精密度

以魚肉為樣品(實測值為未檢出)，做3個水平的添加回收試驗分別為2.0 、5.0 和10.0 μg/kg，每組試驗重復6次 (n=6)。

MG和LMG的平均回收率分別為88%～105%和85%～110%，相對標準偏差RSD均為2.2%～15.3%。該方法回收率和精密度符合國內外標準要求，該方法準確具有可行性。表3

表3 孔雀石綠、隱色孔雀石綠回收率及精密度(n=6)
Table 3 Malachite green, leuco malachite green recovery and precision (n=6)

化合物Compound2.0μg/kg5.0μg/kg10.0μg/kg回收率Recoveryrate(%)相對標準偏差RSD(%)回收率Recoveryrate(%)相對標準偏差RSD(%)回收率Recoveryrate(%)相對標準偏差RSD(%)孔雀石綠(MG)882.2922.81052.3隱色孔雀石綠(LMG)853.79711.711015.3

3 討 論

根據魚肉樣品基質的特點以及MG和LMG的相關物理化學性質，采用1%冰乙酸-乙腈溶液提取，氨基及SCX(強陽離子交換)固相小柱凈化，C18 色譜柱分離，電噴霧串聯四極桿質譜的多反應監(jiān)測掃描模式(MRM)進行檢測，并采用內標法定量。實驗MG和LMG在魚肉中低、中、高 3水平添加下的回收率分別為88%～105%和85%～110%，相對標準偏差(n=6)為2.2%～15.3%。MG和LMG在魚肉中的定量限為 2.0 μg/kg。為快速檢測新疆冷水魚中MG及LMG含量提供方法支持。

4 結 論

該檢測方法與傳統(tǒng)檢測方法相比，前處理步驟少，試劑用量大為減少，操作簡單，檢測速度快，具有更高效、更準確且回收率高、低成本的特點。實驗MG和LMG在魚肉中低、中、高 3水平添加下的回收率分別為88%～105%和85%～110%，相對標準偏差(n=6)為2.2%～15.3%。MG和LMG在魚肉中的定量限為 2.0 μg/kg。在檢測冷水魚等水產品中孔雀石綠(MG)和隱色孔雀石綠(LMG)的實際應用中，效果良好。