晏云濤 呂瑞青 項(xiàng)勛 李朝 楊建發(fā) 段綱

摘要：為了評(píng)價(jià)紫莖澤蘭對(duì)雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)卵囊活性的抑制效果，采用不同濃度紫莖澤蘭提取液處理新鮮的雞球蟲(chóng)卵囊，計(jì)算各組的孢子化率，并將處理后的孢子化卵囊接種幼雞，再進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)克卵囊數(shù)（指1 g糞便中含有的卵囊數(shù)）、抗球蟲(chóng)指數(shù)等指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)紫莖澤蘭對(duì)雞球蟲(chóng)卵囊活性的影響。結(jié)果顯示，紫莖澤蘭處理組的球蟲(chóng)孢子化率受到不同程度的抑制，與對(duì)照組存在顯著差異（P<0.05），對(duì)處理組幼雞進(jìn)行免疫攻毒，其存活率（100%）、抗球蟲(chóng)指數(shù)（186.6）、增質(zhì)量率（99.6%）和病變記分（+0.7）均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，且免疫組與陽(yáng)性對(duì)照組抗球蟲(chóng)指數(shù)之間差異極顯著（P<0.01），表明紫莖澤蘭可致弱雞球蟲(chóng)卵囊活性，為紫莖澤蘭研制成病原致弱劑或殺蟲(chóng)劑奠定了基礎(chǔ)，也為球蟲(chóng)致弱和球蟲(chóng)基因缺失苗的研究提供了新思路。

關(guān)鍵詞：雞球蟲(chóng);紫莖澤蘭;孢子化率;抗球蟲(chóng)指數(shù)

中圖分類號(hào)： S858.31 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0171-03

收稿日期：2018-05-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)（編號(hào)：2017YFD0501405、2017YFD0501303）。

作者簡(jiǎn)介：晏云濤（1994—），女，云南昆明人，碩士研究生，主要從事畜禽寄生蟲(chóng)病研究，

通信作者：段 綱，碩士，教授，主要從事畜禽藥理毒理學(xué)研究。

紫莖澤蘭（Euptorium adenophorum Spreng）是一種外來(lái)入侵植物，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性和侵占能力，會(huì)破壞生態(tài)的多樣性[1]。紫莖澤蘭危害性極強(qiáng)，可以引起人皮膚紅腫，甚至出現(xiàn)接觸性皮炎，牲畜容易誤食紫莖澤蘭，從而引起腹瀉、脫毛、流產(chǎn)甚至死亡[2]，牛、馬等動(dòng)物吸入紫莖澤蘭帶有纖毛的種子和花粉后容易引起哮喘，用紫莖澤蘭墊羊圈，可引起羊蹄腐爛[3]。在國(guó)家生態(tài)環(huán)境部公布的首批入侵國(guó)內(nèi)的16種外來(lái)物種黑名單中，紫莖澤蘭名列第一，被稱為“生物癌癥”[4]。因此，許多科研工作者將目光投向紫莖澤蘭的生態(tài)利用，周世敏等研究表明，以紫莖澤蘭為原料制成的生物碳的燃燒值（4.42×107 J/kg）明顯大于以德國(guó)橡木為原材料生產(chǎn)的生物碳的燃燒值（3.4×107 J/kg）[5];田果廷等用紫莖澤蘭作栽培原料可栽培出田頭菇、平菇、金針菇、柳松茸、香菇和雞腿菇等多種食用菌，其產(chǎn)量高、成本低、營(yíng)養(yǎng)豐富、食用安全[6];王鳳等以紫莖澤蘭草粉為載體制成的芳香防蛀緩釋片劑外形完好且香味持久，可達(dá)3個(gè)月以上[7]。

雞感染球蟲(chóng)?。╟occidiosis）主要通過(guò)攝入有活力的孢子化卵囊，凡被帶蟲(chóng)雞的糞便污染了的飼料、飲水、用具和土壤等，都可能傳播球蟲(chóng)[8-9]，導(dǎo)致家畜飼養(yǎng)環(huán)境的污染。目前，雞球蟲(chóng)病的防治多采用化學(xué)藥物，其產(chǎn)生的耐藥性、肉蛋產(chǎn)品藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題也日趨嚴(yán)重[10]。

本試驗(yàn)選用紫莖澤蘭作用于雞球蟲(chóng)卵囊，通過(guò)攻毒保護(hù)試驗(yàn)，觀測(cè)處理后的卵囊對(duì)雞的免疫保護(hù)效果，為將紫莖澤蘭開(kāi)發(fā)為獸醫(yī)臨床實(shí)踐的植物抑制劑、消毒劑，替代其他化學(xué)消毒藥品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 球蟲(chóng)蟲(chóng)株

本試驗(yàn)所用雞球蟲(chóng)卵囊為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存的雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，于2017年11月通過(guò)感染小雞獲得新鮮卵囊。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

7日齡白羽肉雞，2017年11月購(gòu)自云南省昆明市某市場(chǎng)，在嚴(yán)格消毒的無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境下飼養(yǎng)，器具使用前嚴(yán)格消毒，所用飼料為自行配制，不含驅(qū)蟲(chóng)藥物。試驗(yàn)前鏡檢糞便，確定無(wú)球蟲(chóng)感染。

1.1.3 主要試劑

紫莖澤蘭初提液;0.5%重鉻酸鉀;3% NaOH;飽和食鹽水;95%乙醇。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫莖澤蘭初提液的制備

稱取500 g紫莖澤蘭粉末，加10倍量的95%乙醇，于50 ℃加熱浸提4 h;依次使用60目、200目網(wǎng)篩將浸提液過(guò)濾到滅菌廣口瓶中，用布氏漏斗過(guò)濾，濾渣用95%乙醇再次浸提4 h，過(guò)濾，如此重復(fù)過(guò)濾3次，再將每次過(guò)濾后的濾液混合;濾液經(jīng)60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至黑褐色膏狀物且質(zhì)量不再變化為止;將得到的膏狀濃縮物用電子天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量，然后用滅菌水將膏狀濃縮物配成 1 g/mL 的母液，配好的母液密封、避光，于4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 新鮮雞球蟲(chóng)卵囊的準(zhǔn)備

用筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)卵囊接種15日齡雞，接種量為 7 000個(gè)/羽，嚴(yán)格消毒，分籠飼養(yǎng)，感染后7 d進(jìn)行糞檢，連續(xù)收集 7～9 d 的糞便，收集未孢子化的卵囊。

1.2.3 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

在培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入10 mL 0.5%重鉻酸鉀溶液和104個(gè)分離的球蟲(chóng)卵囊，1～5號(hào)加入一定量的紫莖澤蘭液，調(diào)整其終濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.5%和5.0%，每個(gè)濃度組做3個(gè)平行試驗(yàn);6號(hào)加入0.5 mL蒸餾水作為陰性對(duì)照;7號(hào)加入0.5 mL 3% NaOH作為陽(yáng)性對(duì)照。將各培養(yǎng)皿放入29 ℃溫箱中進(jìn)行孢子化培養(yǎng)，每天用膠頭吸管間斷性吹氣3次，36 h后顯微鏡下計(jì)數(shù)具有感染性卵囊的孢子化率[12]。

1.2.4 紫莖澤蘭處理后的孢子化卵囊感染動(dòng)物試驗(yàn)

將上述試驗(yàn)中5個(gè)不同濃度處理后試驗(yàn)組、陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的孢子化卵囊分別接種15日齡幼雞，接種劑量按照2 000個(gè)/羽，每組接種20羽幼雞，同時(shí)設(shè)接種0.5 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，接種前稱取每組雞的體質(zhì)量。攻毒后6 d進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，10 d后記錄雞死亡和增質(zhì)量情況，剖殺所有雞，進(jìn)行病變記分、計(jì)算抗球蟲(chóng)指數(shù)（ACI）。

1.2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

用紫莖澤蘭液處理的最佳濃度組孢子化卵囊接種（首次免疫）20羽15日齡的小雞，免疫接種劑量為2 000個(gè)/羽，接種后15 d，試驗(yàn)組小雞再用強(qiáng)毒球蟲(chóng)攻毒，攻毒劑量為105個(gè)孢子化球蟲(chóng)卵囊/羽，攻毒后6 d進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，10 d后記錄雞死亡和增質(zhì)量情況，剖殺全部雞進(jìn)行病變記分、計(jì)算ACI;同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組（不免疫攻毒組）、陰性對(duì)照組（不免疫不攻毒空白組）。通過(guò)上述指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)紫莖澤蘭液致弱球蟲(chóng)的免疫保護(hù)力。

1.2.6 評(píng)價(jià)指標(biāo)

克卵囊數(shù)（OPG）、病變記分、血糞值和ACI的計(jì)算參照文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭對(duì)雞球蟲(chóng)孢子化的影響

球蟲(chóng)卵囊孵化3 d后，收集各組球蟲(chóng)卵囊，并計(jì)算各組孢子化率，每組計(jì)算3次，求平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各紫莖澤蘭處理組的球蟲(chóng)孢子化受到了不同程度的抑制（表1），且通過(guò)SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組間孢子化存在顯著差異（P=0.029<0.05）。

2.2 紫莖澤蘭處理后孢子化卵囊感染動(dòng)物的結(jié)果

攻毒后6 d，收集各組雞糞便，用改良麥克馬斯特計(jì)數(shù)板計(jì)算糞便中的OPG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組單位質(zhì)量糞便卵囊數(shù)均小于陽(yáng)性對(duì)照組，且隨著紫莖澤蘭液濃度的增加，單位質(zhì)量卵囊數(shù)有逐漸減小的趨勢(shì)。攻毒后10 d，統(tǒng)計(jì)各組雞的存活率、相對(duì)增質(zhì)量率，剖殺雞，進(jìn)行病變記分，統(tǒng)計(jì)血糞值、ACI，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的雞未有死亡;陰性對(duì)照組雞腸道無(wú)病變發(fā)生，各試驗(yàn)組雞腸道病變程度較陽(yáng)性對(duì)照組輕，詳見(jiàn)圖1至圖7。說(shuō)明紫莖澤蘭液對(duì)雞具有一定的免疫保護(hù)性。各試驗(yàn)組的相對(duì)增質(zhì)量率和抗球蟲(chóng)指數(shù)均高于陽(yáng)性對(duì)照組，各相對(duì)增質(zhì)量率和抗球蟲(chóng)指數(shù)隨著紫莖澤蘭液終濃度的增加也呈提高的趨勢(shì)，且50%和2.5%濃度組表現(xiàn)出了中等抗球蟲(chóng)效果。SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析顯示，試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組間抗球蟲(chóng)指數(shù)存在顯著差異（P=0.018<0.05）。

2.3 紫莖澤蘭處理后孢子化卵囊的免疫保護(hù)結(jié)果

在免疫攻毒后6 d，收集紫莖澤蘭5%濃度試驗(yàn)組與對(duì)照組雞糞便，用改良麥克馬斯特計(jì)數(shù)板計(jì)算OPG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的克卵囊數(shù)顯著少于陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照無(wú)球蟲(chóng)卵囊檢出，詳見(jiàn)表3。免疫攻毒后10 d，統(tǒng)計(jì)各組雞存活率、相對(duì)增質(zhì)量率，剖殺雞，進(jìn)行病變記分，統(tǒng)計(jì)血糞值，計(jì)算ACI，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組雞未有死亡，腸道病變較輕微，只有少量出血，見(jiàn)圖8至圖10。相對(duì)增質(zhì)量率和抗球蟲(chóng)指數(shù)都顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，且抗球蟲(chóng)指數(shù)>180，屬于高效抗球蟲(chóng)，經(jīng)SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析顯示，免疫組與陽(yáng)性對(duì)照組抗球蟲(chóng)指數(shù)之間差異極顯著（P=0<0.01）。由此可見(jiàn)，經(jīng)紫莖澤蘭處理的球蟲(chóng)卵囊對(duì)雞有良好的免疫保護(hù)性。

3 討論

已有報(bào)道表明，紫莖澤蘭具有抑制動(dòng)物寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體或蟲(chóng)卵活性的效果。在26 ℃條件下，紫莖澤蘭花葉提取液作用于馬圓線蟲(chóng)蟲(chóng)卵，隔天取樣5 g用漂浮法記錄蟲(chóng)卵孵化情況，表明高濃度浸泡液中蟲(chóng)卵的檢出率較低，孵出的幼蟲(chóng)不能正常發(fā)育[14];不同分子質(zhì)量的紫莖澤蘭液作用于未孢子化的孔雀球蟲(chóng)卵囊會(huì)抑制其卵囊活性[15];椎實(shí)螺放入紫莖澤蘭不同濃度不同部位的浸泡液中，根莖花葉都具有殺滅螺的效果，僅作用時(shí)間長(zhǎng)短不同[16];紫莖澤蘭95%乙醇提取物對(duì)兔癢螨和疥螨具有較強(qiáng)的離體殺滅活性;紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)牛足螨也有較強(qiáng)的離體殺滅活性[17];紫莖澤蘭經(jīng)甲醇石油醚丙酮萃取后對(duì)黏蟲(chóng)觸殺效果較好的部位是花和葉[18]。

云南省多樣的氣候環(huán)境，導(dǎo)致云南省很多養(yǎng)雞場(chǎng)時(shí)有球蟲(chóng)病發(fā)生，據(jù)報(bào)道，云南省多數(shù)養(yǎng)雞場(chǎng)球蟲(chóng)病的防治成本占全部防治疾病成本的30%[19]。在臨床上，抗球蟲(chóng)藥分為聚醚類離子載體抗生素和化學(xué)合成藥，?其對(duì)球蟲(chóng)的防控和治療發(fā)揮了重要的作用，但由于藥物濫用，導(dǎo)致耐藥蟲(chóng)株產(chǎn)生、藥物殘留、污染環(huán)境等問(wèn)題;部分雞場(chǎng)聯(lián)合使用多價(jià)球蟲(chóng)疫苗，而疫苗使用不當(dāng)導(dǎo)致雞發(fā)病的情況時(shí)有發(fā)生，多價(jià)疫苗的使用也有可能給當(dāng)?shù)貛?lái)以前沒(méi)有的球蟲(chóng)新種。為此，開(kāi)發(fā)新型植物抗球蟲(chóng)藥就顯得尤為迫切。袁銘雅用紫莖澤蘭治療雞球蟲(chóng)病，能干擾蟲(chóng)卵的正常孵化過(guò)程，抑制卵囊的生長(zhǎng)繁殖[20];譚文彪等用紫莖澤蘭花的第三級(jí)提取物治療雞球蟲(chóng)病，其抗球蟲(chóng)指數(shù)為180.20，療效達(dá)到高效[21];和曉銀用紫莖澤蘭的異丙醇提取物2級(jí)分離物對(duì)雞球蟲(chóng)病的治療效果ACI為174，屬于中效偏上[22]。

結(jié)果表明，各試驗(yàn)組ACI隨紫莖澤蘭液濃度的增加而增大，各試驗(yàn)組OPG隨紫莖澤蘭液濃度的增加有逐漸減小的趨勢(shì)，提示紫莖澤蘭提取物能有效抑制雞球蟲(chóng)卵囊的活性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)用紫莖澤蘭提取液處理后的球蟲(chóng)孢子化率顯著低于對(duì)照組，紫莖澤蘭作用的試驗(yàn)組抗球蟲(chóng)指數(shù)顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，且抗球蟲(chóng)指數(shù)>180，屬于高效抗球蟲(chóng)，說(shuō)明紫莖澤蘭抑制了雞球蟲(chóng)孢子化階段的活性。

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