陳艷玲

作者單位：253200 山東德州，夏津縣人民醫(yī)院檢驗科

下呼吸道感染為臨床常見感染性疾病，現(xiàn)已成為導致人類死亡的四大原因之一。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2013 年統(tǒng)計報告顯示，世界病死率最高的十大疾病死因中，下呼吸道感染位列冠心病和中風之后的第3 位（5.9%），而位于第4 位的慢性阻塞性肺疾病（5.4%）死亡也與感染有一定相關性，呼吸道致病菌感染居各類致病菌感染之首［1-2］。傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)和細菌學檢驗技術不能為臨床提供快速準確的診斷結果，導致下呼吸道感染患者未得到及時準確的治療，病死率常年居高不下，而此時繼聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術發(fā)展之后的環(huán)介導等溫擴增技術（loop mediated isothermal amplification，LAMP）在一定程度上彌補了傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)的不足，其中晶芯呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒采用LAMP 技術，可定性檢測痰液標本中13 種臨床常見下呼吸道病原菌。截至目前，LAMP 技術已廣泛應用于諸多領域，成為許多地區(qū)臨床檢測的常用方法［3］。本研究對下呼吸道感染患者的痰液標本進行LAMP 檢測和傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)，檢測呼吸道致病菌菌種，比較兩種方法的差異，分析評價LAMP 檢測下呼吸道病原菌的效果。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2017 年2 月—2018 年10 月366 例下呼吸道感染患者的痰液標本。

1.2 儀器與試劑 采用晶芯呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（LAMP 技術）和RtisochipTM-A 等溫擴增微流控芯片核酸分析儀（博奧生物集團有限公司）；采用VITEK 2 Compact 細菌鑒定儀、血平板、麥康凱平板（法國生物梅里埃公司）和加萬古霉素的巧克力平板（安圖生物公司）；革蘭染色試劑（珠海貝索生物技術有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 合格痰標本初篩 用無菌接種鉤挑取送檢痰液黏液、膿性部分，革蘭染色后低倍鏡視野（low power lens，LP）下鏡檢，多形核白細胞＞25/LP、鱗狀上皮細胞＜10/LP 的合格痰液標本納入研究。

1.3.2 痰培養(yǎng) 選適量膿性或無血部位合格痰標本接種于血平板、加萬古霉素巧克力平板和麥康凱平板，5%～10%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)24 h或48 h，觀察培養(yǎng)情況，篩選可疑致病菌進行鑒定。

1.3.3 LAMP 病原菌檢測 利用晶芯呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒檢測，采用LAMP 技術在微流控蝶式芯片上進行反應，DNA 在一定溫度下（60 ℃～65 ℃）處于動態(tài)平衡狀態(tài)，利用DNA 聚合酶的鏈置換功能，使DNA 在等溫下不斷復制擴增，完成模板DNA 的合成、循環(huán)擴增、伸長和再循環(huán)，根據擴增曲線判讀結果。

1.3.4 結果判定 呼吸道病原菌核酸檢測完成后，軟件采用最大二階導數(shù)法結合其他算法找出“S 型”擴增曲線進入快速擴增期的第1 個拐點，將拐點對應時刻與原點時刻的差值作為時刻差值（Tp 值），本試劑盒采用ROC 法計算得到每種病原菌的陽性判斷值，根據Tp 值并結合陽性判斷值進行結果判讀。當病原菌Tp 值≤陽性判斷值時結果判定為陽性，當病原菌Tp 值＞陽性判斷值時結果判定為陰性。歸一化曲線在“熒光曲線區(qū)域”顯示，質控結果和各指標檢測結果在“檢測結果區(qū)域”顯示。

1.3.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料以率或構成比表示，兩兩比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 痰培養(yǎng)結果 366 份痰液標本中，痰培養(yǎng)檢出陽性標本72 份（陽性率為19.7%）。共檢出108 株致病菌株，其中革蘭陰性（G-）桿菌為86 株（占79.6%），革蘭陽性（G+）球菌22 株（占20.4%），未檢出嗜麥芽窄食單胞菌和肺炎支原體。見表1。

表1 72 份痰培養(yǎng)陽性標本的病原菌檢出情況

2.2 LAMP 檢測結果 366 份痰液標本中，LAMP 檢出陽性標本175 份（陽性率為47.8%），其中單一致病菌感染149 份，2 種及以上致病菌混合感染26 份。共檢出236 株致病菌株，其中G-桿菌168 株（占71.2%），G+球菌68 株（占28.8%），未檢出嗜麥芽窄食單胞菌和肺炎支原體。見表2。

表2 175 份LAMP 陽性標本的病原菌檢出情況

2.3 兩種方法結果比較 LAMP 陽性檢出率明顯高于痰培養(yǎng)（47.8%比19.7%；χ2＝64.826，P＜0.01）。

3 討論

WHO 2013 年統(tǒng)計報告顯示，各種感染性疾病仍嚴重危害人類健康，占全球死亡人數(shù)的1/3，其中呼吸道感染居各類感染性疾病之首。下呼吸道感染主要包括社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）、慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease aecopd，AECOPD）、支氣管擴張合并感染等［4］。由于抗菌藥物在臨床的使用頻率越來越高，菌株耐藥性也逐漸增加，導致院內感染情況愈加嚴重，尤以銅綠假單胞菌、腸球菌和不動桿菌感染為甚［5］。傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)在檢測敏感性和檢測周期等方面難以滿足下呼吸道感染的治療要求。本研究采用等溫擴增芯片法，基于LAMP 原理檢測常見下呼吸道病原體（包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌復合群、肺炎支原體和肺炎衣原體）。LAMP 從痰液標本的最初處理至報告發(fā)放全程僅需2～3 h，檢測時間較傳統(tǒng)痰培養(yǎng)明顯縮短。吳曉睛等［6］研究顯示，LAMP 技術具有較高的靈敏度，檢測結果與痰培養(yǎng)有較高的一致性。

結核病是結核分枝桿菌侵入人體后引起的消耗性疾病，有強烈傳染性，主要經空氣-呼吸道、食物和垂直傳染，目前以肺結核最為多見，90%肺結核通過呼吸道傳染。近幾年結核病的發(fā)病率有所增長，據WHO 報道，每年約有800 萬新病例產生，至少有300 萬人死于結核病。本研究顯示，LAMP 共檢出結核分枝桿菌19 株，檢測時間僅需2～3 h，眾所周知，傳統(tǒng)結核分枝桿菌培養(yǎng)需2～3 周，二者相比，前者從很大程度上縮短了檢測時間，本研究未涉及痰結核分枝桿菌的培養(yǎng)。但郗志華［7］研究表明，LAMP 對結核分枝桿菌檢測有重要的臨床價值，LAMP 陽性率（77.8%）較涂片抗酸染色法（52.78%）明顯升高（P＜0.05），其中涂陽培養(yǎng)的LAMP 陽性率為99.73%，涂陰培養(yǎng)的LAMP 陽性率為58.82%。劉毅等［8］研究顯示，LAMP 檢測結核分枝桿菌的敏感性和特異性較高，操作簡便易行，結果快速準確，且不需要昂貴的檢驗設備，值得基層醫(yī)院推廣應用。

本研究未檢出肺炎支原體和嗜麥芽窄食單胞菌，林牧等［9］研究顯示，LAMP 具有特異性強、穩(wěn)定性高、檢測快速的特點，能快速準確地檢出肺炎支原體，具有較好的推廣應用前景。郭旭光等［10］研究顯示，采用實時熒光LAMP 檢測嗜麥芽窄食單胞菌的穩(wěn)定性高、特異性強、反應速度快，臨床應用價值較高。根據呼吸道感染病原菌檢測結果指導臨床合理應用抗菌藥物，可準確及時地治療呼吸道感染患者［11-12］。本研究痰培養(yǎng)共檢出2株腸球菌，林牧等［9］痰培養(yǎng)共檢出7 例陰溝腸桿菌，而LAMP 由于試劑盒的局限性不能檢出上述兩種細菌。但LAMP 對肺炎衣原體、結核分枝桿菌及嗜肺軍團菌的檢出率較高，這是痰培養(yǎng)無法比擬的，與文獻［12］一致。

綜上所述，LAMP 會進一步向更快速、簡便、特異、可現(xiàn)場檢測、檢出病原菌種類更多的方向發(fā)展，不僅能快速準確地檢出傳統(tǒng)呼吸道病原菌，還能檢出肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌等細菌培養(yǎng)難以檢出的病原菌，可廣泛應用于基層醫(yī)院。當然，由于試劑盒的局限性，LAMP 還無法檢出某些不常見的下呼吸道感染病原菌。兩種檢測方法聯(lián)合應用能為臨床提供準確、可靠、及時的診斷依據。