唐漫喬
作者單位:515834 廣東汕頭,汕頭市澄海區(qū)蓮下中心醫(yī)院檢驗科
2 型糖尿?。╰ype Ⅱ diabetes mellitus,T2DM)屬于多病因代謝疾病,主要是由胰島素缺乏或抵抗引起的代謝紊亂綜合征,且具有遺傳傾向[1]。糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)是血液中血紅蛋白(hemoglobin,Hb)與血糖(blood glucose,Glu)進行非酶結(jié)合的產(chǎn)物,是T2DM 患者療效與預后評估的重要指標之一[2]。HbA1c 濃度不受葡萄糖每日波動的影響,主要反映T2DM 患者過去6~8 周的Glu 濃度水平[3]。隨著醫(yī)學生物科技的發(fā)展,HbA1c 臨床實驗室檢測方法越來越多,各實驗室因所使用的儀器及配套試劑不同,每種檢測方法各有利弊,對同一份標本在同一時間內(nèi)測定的HbA1c 濃度也存在較大差異[4-5]。本研究采用免疫比濁法(turbidimetric inhibition immuno assay,TIIA)和陽離子交換層析法(ion-exchange chromatography,IEC)檢測HbA1c,分析兩種檢測方法的性能,評價TIIA 法和IEC 法檢測HbA1c 的應用價值,以期提高HbA1c檢測的準確性。
1.1 研究對象 選取2018 年1 月—2019 年2 月本院門診接收的T2DM 患者作為研究對象。
1.1.1 納入標準 診斷均符合2014 年美國糖尿病學會糖尿病醫(yī)學診治標準[4]:①空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)PG)≥7.0 mmoL/L;② 口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)2 h Glu≥11.1 mmol/L。
1.1.2 排除標準 ①合并酮癥;② 合并感染;③合并酸堿失衡;④ 合并電解質(zhì)平衡紊亂;⑤ 存在腎臟疾病或心臟病等器質(zhì)性疾病。
1.1.3 倫理學 本研究符合醫(yī)學倫理學標準,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(審批號:S2019-XX-029-01),對患者采取的治療和檢測得到過患者或家屬的知情同意。
1.2 儀器與試劑 IEC 法使用KH-101 型HbA1c全自動檢測儀,儀器、試劑盒和校準品均由深圳市凱特(Caretim)有限公司提供;TIIA 法使用日立7020 型全自動生化分析儀,儀器、試劑盒和校準品均由日本株式會社日立制作所提供;上述檢測詳細操作步驟均按說明書操作。HbA1c 5.0%、15.0%質(zhì)控品由上海信帆有限公司提供(生產(chǎn)批號:181226)。
1.3 檢測方法 采集所有受檢者的空腹肘靜脈血10 mL,使用乙二胺四乙酸二鉀(Ethylenediaminete traacetic acid K2,EDTA-K2)抗凝,剔除明顯溶血或脂血標本,置于超低溫-86 臥式醫(yī)用冰箱(浙江愛雪Iceshare 制冷電器有限公司提供)于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3.1 IEC 法 采用IEC 法定量檢測HbA1c 濃度,其基質(zhì)由帶電荷的樹脂或纖維素組成,帶正電荷的稱為陰離子交換樹脂,而帶負電荷的稱為陽離子樹脂。當?shù)鞍踪|(zhì)都處于不同等電點的pH 條件下,蛋白質(zhì)所帶電子情況均不同。帶陰離子電荷的蛋白質(zhì)能與陰離子交換基質(zhì)結(jié)合,因此這類蛋白質(zhì)被留在柱子上,接著通過改變洗脫液的pH 或鹽離子強度等措施,將吸附在離子交換柱上的帶陰離子電荷的蛋白質(zhì)洗脫下來,按結(jié)合由弱到強的順序?qū)⑾嚓P(guān)蛋白質(zhì)依次洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì),通過改變洗脫液的pH 或鹽離子強度將結(jié)合的帶陽離子電荷的蛋白質(zhì)洗脫下來,并根據(jù)標準曲線計算待測蛋白質(zhì)的濃度[6]。
1.3.2 TIIA 法 利用抗原抗體結(jié)合動態(tài)定量檢測HbA1c 濃度,當合適比例濃度的抗體與抗原在特殊稀釋系統(tǒng)中反應時,在稀釋系統(tǒng)促聚劑的作用下,可溶性免疫復合物自液相析出形成微小顆粒,使反應液出現(xiàn)濁度。當抗體濃度固定在一定范圍之內(nèi)時,形成的免疫復合物量隨檢樣中抗原濃度的增加而增加,反應液分光光度也隨之增加,并根據(jù)標準曲線計算待測抗原濃度[7]。
1.4 精密度試驗 從所有T2DM 患者中隨機抽取30 份患者血液標本混合為1 份(HbAlc 濃度為11.52%),分別采用IEC 法和TIIA 法同時連續(xù)檢測20 d,2 次/d,計算批內(nèi)變異系數(shù)(CV批內(nèi))與批間變異系數(shù)(CV批間)。
1.5 線性相關(guān)分析 分別采用IEC 法和TIIA 法對所有T2DM 患者標本進行檢測,并對HbAlc 檢測結(jié)果進行直線函數(shù)回歸統(tǒng)計。設(shè)Y為IEC 法所測HbAlc 濃度水平,X為TIIA 法所測HbAlc 濃度水平。
1.6 回收試驗 從所有T2DM 患者中隨機抽取9 份不同濃度血液標本,HbAlc 濃度分別為20.14%、17.91%、15.61%、14.63%、11.52%、10.24%、9.29%、8.56%和5.64%,分別采用IEC 法和TIIA 法檢測回收率,每個濃度血液標本檢測20 次。
1.7 相關(guān)保養(yǎng)維護和校準 連續(xù)觀察兩臺儀器運行狀態(tài)1 周,確保兩臺儀器運行穩(wěn)定且狀態(tài)良好。培訓相關(guān)操作者,操作者在熟悉儀器操作和各項實驗步驟后進行各項相關(guān)性能評價,每次操作均帶有HbA1c 的標準品及HbA1c 的質(zhì)控物檢測。
1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,組間比較采用t檢驗。按照美國臨床和實驗室標準 協(xié) 會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)EP15-A 文件要求[8],兩種檢測方法在進行線性相關(guān)分析時,直線函數(shù)回歸統(tǒng)計方法采用Linear Regression 線性回歸,計算回歸方程為Y=aX+b,相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 患者一般資料 共納入168 例T2DM 患者。其中男性84 例,女性84 例;年齡32~74 歲,平均(47.8±8.9)歲。所有患者的性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),具有可比性。
2.2 精密度試驗 IEC 法在同一批次檢測中的CV批內(nèi)和CV批間均明顯優(yōu)于TIIA 法(均P<0.05)。見表1。
表1 兩種方法檢測HbA1c 的CV批內(nèi)與CV批間比較
2.3 線性相關(guān)分析 IEC 法測得的HbAlc 濃度水平與TIIA 法存在一元回歸直線方程關(guān)系,TIIA 法(X)與IEC 法(Y)存在較好的正相關(guān)直線性回歸關(guān)系。相關(guān)性分析回歸方程為Y=0.97X+1.23Y,相關(guān)系數(shù)R2=0.991。見圖1。
圖1 IEC 法與TIIA 法檢測HbAlc 濃度的回歸方程曲線
2.4 回收率試驗 IEC 法的平均回收率明顯優(yōu)于TIIA 法(P<0.05)。見表2。
表2 兩種檢測方法的回收率試驗結(jié)果比較
T2DM 是一種常見慢性疾病,因病程較長,且大多數(shù)患者Glu 控制不太理想,常處于較高水平,容易導致人體代謝功能紊亂[9],誘發(fā)靶器官(包括心腦血管、視網(wǎng)膜、神經(jīng)纖維和腎臟)并發(fā)癥及功能障礙等,嚴重影響患者身心健康和生活質(zhì)量[10]。HbAlc是Glu 與Hb 結(jié)合所形成的產(chǎn)物,HbAlc 合成速度與Glu 濃度呈正比,不受血糖暫時性升高的影響,不需要空腹,具有不可逆性、無需特定時間段抽取靜脈血和分析前不穩(wěn)定等特點,可真實有效地反映T2DM 患者一段時間內(nèi)(前120 d)Glu 控制情況,且不易受藥物、情緒、應激、運動和飲食等因素的影響[11]。雖然臨床上檢測HbAlc 的敏感性和特異性較好,但各生產(chǎn)廠商HbAlc 試劑盒質(zhì)量參差不齊,操作方法各異,使不同廠商在檢測HbAlc 時存在重復性差、準確度不高等情況,導致HbAlc 的檢測結(jié)果出現(xiàn)較大誤差,有時甚至容易誤診。為提高T2DM患者HbAlc 的檢測敏感性和特異性,近幾年臨床檢驗工作者都在嘗試尋找敏感性和特異性更高、操作方式更便捷的HbAlc 檢測方法。
本研究結(jié)果表明,IEC 法的批內(nèi)和批間精密度、平均回收率均優(yōu)于TIIA 法。IEC 法和TIIA 法具有可比性和較好的相關(guān)性。IEC 法經(jīng)典的離子交換原理是利用各種蛋白質(zhì)分子在所設(shè)計檢測條件下攜帶電荷類型及電荷量不同,與離子交換劑結(jié)合的強度不同,可用不同檢測條件(離子強度、溫度、pH 值)洗脫出不同蛋白質(zhì)組分的一種層析法。IEC法使用KH-101 型全自動HbA1c 分析儀,采用梯度洗脫組合技術(shù),二元洗脫液無級連續(xù)變化,實現(xiàn)HbA1c 與HbA1ab 和HbA0 的完全分離。該儀器自動化程度較高,僅需將抗凝全血置于儀器標本架上,無需手工干預,即可自動溶化細胞,混勻標本、適當稀釋標本進行自動化檢測,使用指數(shù)模式的高斯對數(shù)(Gaussian logarithm,EMG),結(jié)合微積分擬合計算出分析結(jié)果和分析圖譜,根據(jù)標準曲線直接換算出HbA1c 檢測結(jié)果,全程計算機控制全自動化完成,消除人為不熟練因素的影響[12]。TIIA 法使用單克隆或多克隆抗體直接測定Hb β 鏈糖基化N末端的4~8 個氨基酸,溶血劑中使用十四烷基三甲基溴化銨為洗滌劑,因TIIA 法標本需要預處理,手工溶血及稀釋后才能使用日立7020 型全自動生化分析儀進行檢測,由于TIIA 法反應中難免出現(xiàn)“HOOK”現(xiàn)象,即在進行抗原與抗體的標本測定時,待測標本中的抗原物質(zhì)HbA1c 濃度升高至檢測限值的高濃度范圍,其測定的吸光度(A)值隨抗原物質(zhì)HbA1c濃度升高而開始下降,容易造成漏檢,必須將待測標本重新稀釋至檢測上限濃度,才可以準確檢測出抗原物質(zhì)HbA1c 濃度結(jié)果。TIIA 法受操作者因素影響大,操作繁瑣且受HbA1c 濃度范圍、溶血、脂血和黃疸等標本因素影響,HbA1c 檢測結(jié)果存在重復性差、準確度不高的情況[13]。
綜上所述,從方法學角度分析,IEC 法檢測全血HbAlc精密度優(yōu)于TIIA法,且與TIIA法相關(guān)性較好,同時IEC 法可動態(tài)觀察T2DM 療效和監(jiān)測病情,具有準確率高、快速簡便的特點,適合臨床推廣使用。