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        幼年期實驗用食蟹猴血液學指標測定與比較

        2019-11-01 06:23:14何鋼華廖金娥陳結(jié)文黃慶宇吳志恒陳梅麗
        中國比較醫(yī)學雜志 2019年10期
        關(guān)鍵詞:實驗

        何鋼華,廖金娥,陳結(jié)文,黃慶宇,羅 群,吳志恒,陳梅麗,盧 麗*

        (1.廣州春盛生物研究院有限公司,廣州 510900; 2.廣東省實驗動物監(jiān)測所(廣東省實驗動物重點實驗室),廣州 510663)

        非人靈長類實驗動物與人類的遺傳物質(zhì)有75%~98.5%的同源性[1],在系統(tǒng)發(fā)育上與人類接近,在生理學、解剖學、免疫學以及神經(jīng)學方面有許多相似之處[2],是研究人類健康和疾病的理想實驗動物,其生物學特性對藥理學、毒理學及藥物安全性評價等方面的研究具有重要的意義[3]。廣東省非人靈長類實驗動物存量達80 000只,占全國總存量1/3,以食蟹猴為主,每年出口歐美的標準化實驗猴數(shù)量超過6000只[4],豐富的實驗猴資源,是研究人類相關(guān)疾病及毒理學研究的良好模型動物[5]。但其在疾病模型的開發(fā)應(yīng)用方面仍然非常有限,自發(fā)性疾病模型的開發(fā)尚為欠缺,資源的附加值還有很大的提升空間。因此,建立廣東省內(nèi)幼年期具體年齡段實驗用食蟹猴的血液學指標參考值不僅對其應(yīng)用提供重要的參考意義,且對食蟹猴日常疾病的診斷及動物模型的開發(fā)意義深遠。本實驗對幼年期具體年齡段正常食蟹猴的血液學指標測定,并進行性別間比較,為其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物

        1~2周歲(1≤x<2)食蟹猴273只,雌性124只,雄性149只;2~3周歲(2≤x<3)食蟹猴307只,雌性244只,雄性63只;3~4周歲(3≤x<4)食蟹猴273只,雌性124只,雄性149只。所選食蟹猴均為正常未用于實驗的動物。級別:普通級;動物提供單位:廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司[SCXK(粵)2014~0027]。飼養(yǎng)條件:于廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司內(nèi)群居飼養(yǎng)[SYXK(粵)2015~0152],環(huán)境溫度:18℃~26℃,相對濕度40%~70%,照明:采用12 h/12 h晝夜明暗交替。已經(jīng)通過廣東省實驗動物監(jiān)測所IACUC的審查,編號為:IACUC 2018002。在滿足實驗動物3R原則的基礎(chǔ)上為實驗動物提供充足的動物福利。

        1.2 主要試劑與儀器

        血紅細胞分析用稀釋液(CELLPACK DFL)、Hb溶血劑(SULFOLYSER)、WNR溶血劑(Lysercell WNR)、WDF溶血劑(Lysercell WDF)、WDF染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT熒光染色液(Fluorocell PLT)(批號分別為:A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094,日本SYSMEX(希森美康)株式會社)。血液分析儀XN-1000 V[B1]型(日本Sysmex株式會社)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 標本采集

        動物禁食12 h后,非麻醉狀態(tài)下使用2 mL含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管對實驗動物采用前肢頭靜脈采血2 mL,保存樣本并于1.5 h送檢。

        1.3.2 血液學指標測定

        使用Sysmex XN~1000 V 全自動血液分析儀對動物抗凝血進行以下指標測定:白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞比積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板計數(shù)(PLT)、紅細胞分布寬度-標準差(RDW-SD)、紅細胞分布寬度-變異系數(shù)(RDW-CV)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、大血小板比率(P-LCR)、血小板比積(PCT)、中性粒細胞(NEUT#)、淋巴細胞(LYMPH#)、單核細胞(MONO#)、嗜酸性粒細胞(EO#)、嗜堿性粒細胞(BASO#)、中性粒細胞百分比(NEUT%)、淋巴細胞百分比(LYMPH%)、單核細胞百分比(MONO%)、嗜酸性粒細胞百分比(EO%)、嗜堿性粒細胞百分比(BASO%)。

        1.3.3 參考值范圍建立

        1.4 統(tǒng)計學方法

        2 結(jié)果

        2.1 參考值范圍的建立

        2.2 1~2周歲(1≤x<2)食蟹猴血液學指標

        雄性動物與雌性動物相比較,在紅細胞方面,雌雄動物沒有顯著性差異(P>0.05)。免疫細胞中LYMPH、BASO、NEUT指標差異極顯著(P<0.01),其中雄性動物BASO和LYMPH顯著低于雌性動物,而NEUT則雄性動物顯著高于雌性動物(P<0.05)。血小板方面,PLT及P-LCR在雌雄動物間差異極顯著(P<0.01),PDW及MPV則在雌雄動物間差異顯著(P<0.05),除雄性動物PLT極顯著高于雌性動物外(P<0.01),P-LCR、PDW、MPV均顯著低于雌性動物(P<0.05)。其余指標均沒有顯著性差異,詳見表2。

        2.3 2~3周歲(2≤x<3)食蟹猴血液學指標

        2~3周歲雌雄食蟹猴血液學指標相比較,紅細胞指標除RDW-SD雄性動物顯著低于雌性動物外(P<0.05),其余指標均沒有顯著性差異(P>0.05)。免疫細胞除BASO指標雄性動物極顯著低于雌性動物外(P<0.01),其余指標均無顯著性差異。而血小板方面,雄性動物PDW、MPV及P-LCR極顯著低于雌性動物(P<0.01),其余各指標均無顯著性差異,詳見表3。

        表1 幼年期食蟹猴血液學指標參考范圍

        注:1~2周歲(1≤x<2)、2~3周歲(2 ≤x<3)、3~4周歲(3 ≤x<4)食蟹猴數(shù)量分別為273、307、273只。

        Note. The number of cynomolgus monkeys aged 1-2 (1≤x<2), 2-3 (2≤x<3) and 3-4 (3≤x<4) years were 273, 307 and 273, respectively.

        表2 1~2周歲(1≤x<2)食蟹猴血液學指標

        注:雄性動物149只,雌性動物124只;與雄性動物相比,*P<0.05,**P<0.01。

        Note. Number of male monkeys is 149 and female monkeys is 124. Compared with the males,*P<0.05,**P<0.01.

        表3 2~3周歲(2≤x<3)食蟹猴血液學指標

        注:雄性動物63只,雌性動物244只;與雄性動物相比,*P<0.05,**P<0.01。

        Note. Number of male monkey is 63 and female monkey is 244. Compared with male,*P<0.05,**P<0.01.

        表4 3~4周歲(3≤x<4)食蟹猴血液學指標

        注:雄性動物149只,雌性動物124只;與雄性動物相比,*P<0.05,**P<0.01。

        Note. Number of the male monkeys is 149 and female monkeys is 124. Compared with the males,*P<0.05,**P<0.01.

        2.4 3~4周歲(3≤x<4)食蟹猴血液學指標

        雌雄動物相比較,紅細胞方面,雄性食蟹猴RBC顯著高于雌性,而MCV、RDW-SD則顯著低于雌性食蟹猴(P<0.05),其余各指標均無顯著性差異(P>0.05);在免疫細胞方面,WBC差異顯著(P<0.05),而LYMPH、NEUT和EO差異極顯著(P<0.01),除NEUT雄性動物極顯著低于雌性動物外,雄性動物WBC、LYMPH、EO顯著高于雌性動物(P<0.05),其余各指標無統(tǒng)計學意義。血小板方面,雄性動物PLT顯著高于雌性動物,而PDW顯著低于雄性動物(P<0.05),雄性動物MPV、P-LCR則極顯著低于雌性動物(P<0.01),其余各指標無顯著性差異,詳見表4。

        2.5 各年齡段血液學變化趨勢

        免疫細胞計數(shù)方面,動物隨年齡的增長,其WBC、BASO呈下降趨勢;雌雄動物LYMPH指標在1~3周歲緩慢下降,而雄性動物則在3~4周歲呈上升趨勢;雌雄動物NEUT在1~4周歲呈上升趨勢,而雄性動物在1~3周歲上升,在3~4周歲下降,如圖1所示。

        血小板指數(shù)方面,MPV、PDW、P-LCR指標雌性動物高于雄性動物且在隨年齡的增長而下降;相反,雄性動物PLT遠高于雌性動物,且兩者均在1~2周歲緩慢減少而在3~4周歲時增加,如圖2所示。

        紅細胞方面,雌性動物和雄性動物RBC、HCT、HGB指標在其兩歲以下均呈下降趨勢,而在3~4歲時增加且雄性高于雌性;雌性動物MCV、MCH在1~4周歲年齡段高于雄性動物,且均在1~2周歲呈上升趨勢,在3~4周歲呈下降趨勢,見圖3。

        圖1 免疫細胞計數(shù)各年齡段變化趨勢Figure 1 Trends of immune cell counts in different age groups

        圖2 血小板計數(shù)及血小板指數(shù)各年齡段變化趨勢Figure 2 Trends of platelet counts and platelet indexes in different age groups

        圖3 紅細胞計數(shù)及紅細胞指數(shù)各年齡段變化趨勢Figure 3 Trends of erythrocyte counts and erythrocyte indexes in different ages

        3 討論

        藥物的藥效學研究、非臨床安全性評價研究及臨床前安全性評價研究是新藥研發(fā)的核心內(nèi)容。非人靈長類實驗動物是藥物新陳代謝研究的良好載體,在已研究的化合物中,71%證實藥物在猴體內(nèi)代謝和人體內(nèi)代謝近似性好[10],關(guān)于食蟹猴的血液學指標數(shù)據(jù)目前已有報道[11-14],且本研究相關(guān)指標與文獻報道存在差異。除了年齡和性別為主要影響因素外,動物個體年齡跨度較大,血液生理指標多受地域來源、環(huán)境、采集及儲存方式、檢測儀器等多方面因素的影響而存在差異[15]。

        廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司食蟹猴存欄多達20 000余頭,10多年來因廣東從化優(yōu)越的氣候環(huán)境和地理條件而穩(wěn)定繁育。根據(jù)獸醫(yī)的日常觀察與經(jīng)驗,1周歲的食蟹猴大致相當于人類的4周歲,本研究隨機選用該公司幼年期不同年齡段正常實驗用食蟹猴共853只進行血液學指標的測定與研究,大量的實驗動物樣本量為其血液學參考值范圍的建立提供支撐,參考值范圍見表1。

        本研究實驗結(jié)果表明:年齡差異及性別差異可能對食蟹猴血液學某些指標如RBC、HGB、WBC、LYMPH、PLT等存在影響。

        紅細胞方面,動物在3周歲前,雌性動物其紅細胞數(shù)量如HGB、HCT、MCV、MCH等普遍高于雄性動物,而在3~4周歲的年齡段,雄性動物紅細胞如RBC、HGB等明顯升高并高于雌性動物,見圖3。可能為幼年猴機體為滿足氣體交換,促進新陳代謝而表現(xiàn)的正常狀況,而后期雄性動物紅細胞升高則可能與機體生長發(fā)育有關(guān),雄性激素分泌水平升高促進蛋白合成,從而利于紅細胞生成;雄性食蟹猴RBC高于雌性,這也可能與雌性食蟹猴的月經(jīng)生理周期相關(guān),張曉鈿等[16]、Schuurman等[17]及Kwon等[18]亦先后報道了此問題,且檢測結(jié)果與本研究實驗結(jié)果相似。與石巧娟等[7]結(jié)果相比較,其幼年期組(18~36月齡)紅細胞以MCV、MCH偏低,其余指標基本一致。王崇圳等[19]報道的結(jié)果中,其MCV及MCH指標雄性動物高于雌性動物與本研究結(jié)果相反;與李偉等[20]結(jié)果比較,其4~6歲雌性群居食蟹猴RBC、HGB高于本研究結(jié)果,而其MCV及MCH偏低??赡転閭€體發(fā)育性成熟、環(huán)境氣候、地理位置、動物數(shù)量及動物應(yīng)激等因素所導致。與兒童的紅細胞參數(shù)相比較[21],其變化趨勢基本一致。

        免疫細胞方面,3周歲前動物的免疫細胞數(shù)量較多,在3~4周歲時多呈下降趨勢且雄性動物WBC、LYMPH高于雌性動物,見圖1??赡転槟暧椎氖承泛镆蛎庖呦到y(tǒng)、免疫器官尚未發(fā)育完善而高于其他年齡段;與相關(guān)已報道的文獻相比較,大致年齡段3~4周歲的食蟹猴其WBC、LYMPH指標雄性高于雌性,與本研究結(jié)果相一致。與張曉鈿等[16]、劉士剛等[14]、石巧娟等[12]結(jié)果相比較,WBC及LYMPH指標均為雄性動物高于雌性動物,而本研究實驗結(jié)果相對偏高??赡芘c應(yīng)激誘導條件有關(guān),提示建立實驗室生物數(shù)據(jù)時應(yīng)考慮到不同區(qū)域、動物不同性別、不同年齡及年齡跨度的不同而存在的差異性。參考正常人類不同年齡外周循環(huán)白細胞計數(shù),4~12周歲兒童免疫細胞隨年齡的增長而下降,其變化伴隨免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟過程[21],也可能為地域性差異所導致[6],食蟹猴免疫細胞變化情況與人類相比較基本一致[21]。

        血小板方面,血小板指數(shù)(MPV、PDW、P-LCR)呈下降趨勢且雌性動物高于雄性動物,而PLT數(shù)量則雄性顯著高于雌性且在3~4周歲時呈上升趨勢,見圖2??赡転橛啄陝游锷L發(fā)育階段,骨髓細胞增殖、分化為造血干細胞,血小板因巨核細胞的增多而呈調(diào)節(jié)性變化。與石巧娟等[12]、李巖等[13]研究結(jié)果相一致。與劉士剛等[14]結(jié)果相比,其3~5歲齡食蟹猴PLT指標偏低,其余指標基本一致。與李偉等[20]、田朝陽等[22]結(jié)果比較,其雌性動物PLT指標均偏低,且隨年齡增加而呈下降趨勢,可能為動物數(shù)量、地域因素、年齡跨度大因素導致。這也提示動物隨年齡的增長其血小板計數(shù)有下降的趨勢[23]。本研究結(jié)果也顯示動物血小板指數(shù)隨年齡增長有所下降,PLT雄性動物高于雌性,可能由于雄性動物活潑好動而致使PLT高于雌性動物[23],亦可能雌性動物處于生理周期所引起。

        因幼年動物處于生長發(fā)育階段,而3~4周歲的食蟹猴恰好亦處于向性成熟階段過渡,因此血液學各指標在該年齡段變化較大。本研究提供了較常用于實驗的幼年期食蟹猴具體年齡段的背景數(shù)據(jù),初步建立廣東省內(nèi)幼年期食蟹猴血液學指標參考值范圍,為應(yīng)用食蟹猴進行藥物的藥效學研究及非臨床安全性評價研究等方面提供血液學指標的參考及支撐數(shù)據(jù)。

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