劉艷菊，葛 鵬，徐德璐，鐘 飛，蘭天龍，周博宇，胡 雷*

(1.天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津 300301； 2.天津市新藥非臨床評價技術(shù)工程中心，天津 300301)

比格犬血壓的檢測方法包括傳統(tǒng)的麻醉動物插管法和新興的生理遙測技術(shù)。插管法是通過插管手術(shù)檢測麻醉動物的生理信號，由于手術(shù)創(chuàng)傷和麻醉劑的作用，容易引起動物應(yīng)激，導(dǎo)致血壓、心電、呼吸等生理信號產(chǎn)生較大波動，并且監(jiān)測時間很受限制，很難實現(xiàn)對血壓等生理參數(shù)進(jìn)行長期有效監(jiān)測[1]。應(yīng)用生理遙測技術(shù)可以同時對動物在清醒狀態(tài)下的心電、血壓、呼吸等指標(biāo)[2]進(jìn)行檢測，由生理遙測技術(shù)所采集數(shù)據(jù)的可靠性已經(jīng)得到各國專家的認(rèn)可，因此《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》建議采用遙測技術(shù)進(jìn)行清醒動物心血管系統(tǒng)指標(biāo)的測定。

目前國內(nèi)通過遙測技術(shù)檢測比格犬血壓的方法主要分為尾套法和植入法。尾套法是在比格犬尾根部綁上壓力綁帶，應(yīng)用遙測技術(shù)通過周期性循環(huán)充放氣間接檢測動物血壓。相較于傳統(tǒng)的插管法，尾套法檢測的是清醒動物的血壓，排除了麻醉藥對生理指標(biāo)的干擾，但是該方法只能間斷性的、間接的檢測動物血壓，無法持續(xù)、直觀的觀察血壓的變化，數(shù)據(jù)離散度大、重復(fù)性差[1-3]，并且受充氣放氣時間限制，測量數(shù)值少，不適合應(yīng)用于對血壓影響較敏感的藥物實驗[4]。植入法是通過手術(shù)方法將生物傳感器植入動物體內(nèi)，再由接收和顯示等一系列裝置來測定清醒狀態(tài)下實驗動物的生理指標(biāo)，如血壓、心率、心電圖、呼吸等。目前國內(nèi)比較常用的生物傳感器為DSI公司生產(chǎn)的植入子[5-7]，但是DSI植入子造價較高，限制了其在GLP實驗室的廣泛應(yīng)用。

本研究旨在建立一種數(shù)值更加穩(wěn)定、可靠，并且造價更為低廉的模型犬生理遙測系統(tǒng)，為我國安全藥理學(xué)研究提供技術(shù)支撐與參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級10～11月齡比格犬，體重為9～11 kg，上海新岡實驗動物場提供[SCXK(滬)2017-0006]。飼養(yǎng)于天津藥物研究院新藥評價有限公司動物實驗樓[SYXK(津)2016-0009]，單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)間溫度控制在16℃～26℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)每小時不少于8次全新風(fēng)，光照為12 h明12 h暗交替。實驗動物的使用完全遵守中華人民共和國的相關(guān)實驗動物福利的管理規(guī)定，動物使用前向本中心的動物福利委員會(IACUC)提出申請，經(jīng)動物福利委員會批準(zhǔn)后使用。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(每瓶25 g，德國默克)；注射用氨芐西林鈉(每瓶0.5 g，石藥集團(tuán)中諾藥業(yè))；硫酸阿米卡星注射液(2 mL∶0.2 g，齊魯制藥有限公司)；硫酸阿托品注射液(1 mL∶0.5 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；肝素鈉注射液(1 mL∶1.25萬單位，天津生物化學(xué)制藥有限公司)。

生理信號遙測系統(tǒng)(型號EMKApack8A-6E-2RESP-ACT-TEMP-NIBP-VAP，法國EMKA公司生產(chǎn))；VAP血管通路(產(chǎn)品編號INLINEPORT-AC-7IS，美國Norfolk醫(yī)藥生產(chǎn))；手術(shù)器械、注射器、敷料等。

1.3 實驗方法

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備

術(shù)前1 d，剃除犬頸部至背部之間的被毛，并用紗布蘸取溫水擦拭裸露皮膚，隔夜禁食。為避免麻醉或手術(shù)過程中發(fā)生嘔吐，麻醉前30 min肌注1支硫酸阿托品注射液。

(一)VAP植入手術(shù)(見圖1)

圖1 VAP植入示意圖Figure 1 Schematic diagram of the VAP implantation

動物麻醉后剝離一側(cè)頸動脈，在動物背部做一切口，從背部切口向頸部切口做一皮下隧道，將注滿生理鹽水的VAP血管通路穿過皮下隧道，一端置于背部切口，另一端置于頸部切口。將分離出的頸動脈近心端用靜脈夾夾住，遠(yuǎn)心端結(jié)扎并在近心側(cè)剪一小口，將頸部切口處的通路導(dǎo)管從動脈切口處向近心端方向插入4～8 cm，雙側(cè)結(jié)扎，將埋在背部皮下的通路導(dǎo)管套上硅膠塞固定，并用生理鹽水沖洗導(dǎo)管，1000 IU/mL的肝素鈉溶液封管，最后縫合包扎，放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3.2 術(shù)后護(hù)理

(一)抗感染處理

術(shù)后應(yīng)給予常規(guī)抗感染治療，肌注2支注射用氨芐西林鈉和1支硫酸阿米卡星，抗生素治療至少5 d，視動物恢復(fù)情況可適當(dāng)延長療程。每天用碘伏涂抹創(chuàng)口消毒并及時更換紗布，保持創(chuàng)口的清潔。如發(fā)生創(chuàng)口感染，應(yīng)用大量生理鹽水沖洗傷口，涂抹碘伏，并適當(dāng)加大抗生素劑量或更換抗生素品種。通常7～10 d可拆除縫合線，拆線后根據(jù)創(chuàng)口情況予以消毒。

(二)抗凝處理

術(shù)后連續(xù)3 d，每天用注射器插入硅膠塞抽取導(dǎo)管內(nèi)陳舊血液，然后用生理鹽水沖洗導(dǎo)管，最后用2 mL∶1.25萬單位的肝素鈉注射液封管，之后每隔3 d進(jìn)行一次抗凝處理，連續(xù)3周后改為每周1次。

(三)減壓處理

術(shù)后部分動物頸部創(chuàng)口會有血性滲出導(dǎo)致局部腫脹、內(nèi)壓增高，此時要及時穿刺抽取滲出物，以減輕局部壓力，利于手術(shù)恢復(fù)。穿刺時，動物采取站位，專人保定，局部消毒，選擇低位作為進(jìn)針點。觀察抽出液體的顏色、澄明度和體積，穿刺完畢要及時消毒。

(四)術(shù)后營養(yǎng)補(bǔ)充

由于受到手術(shù)的刺激與損傷，有些動物會出現(xiàn)食欲下降的情況，可以適當(dāng)通過靜脈推注葡萄糖注射液和生理鹽水來補(bǔ)充能量，對于飲食正常的動物可適當(dāng)增加喂食量，使動物多攝入營養(yǎng)，盡快恢復(fù)體力，以利于創(chuàng)口愈合。

(五)模型犬?dāng)?shù)據(jù)采集

動物創(chuàng)口愈合后，將模型犬胸腹部被毛剃出，分別在左、右兩側(cè)第6肋間與胸骨的連接處和第1對乳頭下緣的皮膚表面粘上心電電極貼，然后將模型犬固定于輸液架上的布兜內(nèi)；將呼吸綁帶系于動物胸腔劍突處，連接呼吸換能器；將壓力換能器上的采集針與埋入動物體內(nèi)的VAP血管通路的硅膠塞相連接，最后將心電電極、呼吸換能器和壓力換能器與采集盒連接，打開采集盒即可檢測血壓、心電和呼吸指標(biāo)。

(六)觀察指標(biāo)

血壓指標(biāo)：舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)、平均動脈壓(MBP)；心電指標(biāo)：心率、PR間期、QRS波群、R波電壓、P波電壓、S-T段電壓、QT間期、QTc間期；呼吸指標(biāo)：呼吸頻率和呼吸幅度。心電指標(biāo)采樣頻率為500 Hz，血壓指標(biāo)采樣頻率為200 Hz，呼吸采樣頻率為200 Hz。應(yīng)用EMKA生理信號遙測系統(tǒng)的iox軟件采集數(shù)據(jù)，ecgAUTO軟件分析各指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 比格犬生理遙測系統(tǒng)穩(wěn)定性的驗證

6只VAP模型犬每周檢測一次血壓、心電和呼吸指標(biāo)，數(shù)據(jù)采集時間限定在08:00～10:00之間，避開飼養(yǎng)員喂食和清掃時間，檢測周期為四周，將比格犬四次的生理指標(biāo)進(jìn)行多重比較可見：模型犬四周的血壓平穩(wěn)、心率較齊、心電各指標(biāo)未見明顯波動，盡管呼吸頻率和呼吸幅度出現(xiàn)輕微波動，但是未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(見表1～3)。

2.2 清醒犬與麻醉犬生理指標(biāo)的比較

應(yīng)用EMKA生理信號遙測系統(tǒng)采集24只VAP模型犬清醒狀態(tài)下和24只麻醉犬穩(wěn)定狀態(tài)下的生理指標(biāo)。從數(shù)據(jù)上看，麻醉犬舒張壓、收縮壓和平均動脈壓均明顯高于模型犬；與清醒模型犬比較，麻醉犬心率明顯加快，P-R間期縮短，QTc間期顯著延長，并且R波、P波和S-T段電壓也出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異；此外，麻醉犬呼吸頻率和呼吸幅度均低于模型犬(見表4～6)。

表1 VAP模型犬血壓

表2 VAP模型犬心電

表3 VAP模型犬呼吸

表4 清醒犬與麻醉犬血壓的比較

注：與清醒犬組相比，*P<0.05。

Note.Compared with the conscious dog group，*P< 0.05.

表5 清醒犬與麻醉犬心電的比較

注：與清醒犬組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the conscious dog group，*P< 0.05.

表6 清醒犬與麻醉犬呼吸的比較

注：與清醒犬組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the conscious dog group，*P< 0.05.

2.3 比格犬生理遙測系統(tǒng)敏感性的驗證

6只VAP模型犬灌胃給予阿齊沙坦酯，與給藥前比較，藥后1、2小時動物舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)和平均動脈壓(MBP)降低(見圖2)，與文獻(xiàn)[8-10]報道的阿齊沙坦酯降壓的藥理作用一致，說明本系統(tǒng)能靈敏檢測到血壓指標(biāo)的的相關(guān)變化。特非那定為典型的QT 間期延長藥物[11-12]，4只模型犬灌胃給予特非那定，與給藥前比較，藥后比格犬心率下降，PR間期、QRS波群延長，QTc 間期明顯延長，結(jié)果與文獻(xiàn)[13]報道基本一致(見圖3)。

注：給藥后與給藥前比較，*P<0.05，** P <0.01。圖2 VAP模型犬給藥前后血壓的比較Note. Compared after administration with before administration, *P<0.05，** P <0.01.Figure 2 Comparison of the blood pressure before and after drug administration in the VAP model dogs

注：給藥后與給藥前比較，*P<0.05，**P <0.01。圖3 VAP模型犬給藥前后心電的比較Note. Compared after drug administration with before administration, *P<0.05，**P <0.01.Figure 3 Comparison of the ECG before and after drug administration in the VAP model dogs

3 討論

要想獲得成功的VAP動物模型，首先要有合格的實驗動物作為保證，術(shù)前在挑選動物時，應(yīng)選擇體格健壯、比例勻稱的成年比格犬，便于統(tǒng)一VAP血管通路的植入及位置固定；由于檢測的是動物清醒狀態(tài)下的指標(biāo)，因此應(yīng)選擇性格溫順、依從性強(qiáng)的動物。其次，在手術(shù)過程中要做好消毒工作，盡量接近無菌條件；頸部和背部的創(chuàng)口不宜過大，以免破壞皮下小血管造成失血，影響術(shù)后恢復(fù)；不同動物導(dǎo)管植入位置盡量統(tǒng)一，例如均植入右側(cè)頸動脈，硅膠塞埋入皮下位置不宜過深，否則影響血壓采集針的進(jìn)入，而且埋入位置應(yīng)避開創(chuàng)口，以防影響創(chuàng)口愈合，導(dǎo)管在皮下的走形應(yīng)盡量避免出現(xiàn)多次回彎和折疊，否則會影響血壓的傳導(dǎo)，導(dǎo)管進(jìn)入血管的深淺和結(jié)扎線的松緊同樣會影響血壓信號的傳導(dǎo)。最后，術(shù)后一定要做好抗感染治療，根據(jù)動物恢復(fù)情況適當(dāng)延長抗生素給藥時間，或者及時更換抗生素，若皮下有滲出液應(yīng)及時引流；術(shù)后抗凝處理是模型成功的關(guān)鍵，應(yīng)定時對模型進(jìn)行抗凝處理，針對個別容易產(chǎn)生血栓的動物可適當(dāng)增加抗凝頻率，在日常一般觀察中應(yīng)密切觀察模型動物是否出現(xiàn)栓塞癥狀，對于栓塞動物酌情進(jìn)行溶栓治療，對于無搶救價值的動物應(yīng)實施安樂死并進(jìn)行剖檢，便于總結(jié)積累經(jīng)驗，更好的指導(dǎo)下次手術(shù)。此外，在模型犬的使用過程中一些內(nèi)外界的干擾因素也不容忽視，例如動物的指標(biāo)存在正常生理波動、動物進(jìn)食、人員靠近、外界噪音等也可以影響動物的生理活動，因此在動物進(jìn)入正式實驗前應(yīng)對動物進(jìn)行馴化，提高動物抗干擾能力，并且在采集數(shù)據(jù)時應(yīng)盡量減少人工干預(yù)和外來刺激，例如減少實驗人員的輪換、增強(qiáng)實驗室的隔音效果等。

在VAP模型犬穩(wěn)定性研究中可見，模型犬四周之內(nèi)血壓、心電基本上無差異變化，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，具有可重復(fù)性；四次呼吸指標(biāo)兩兩比較均未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，但是從數(shù)據(jù)上看，與第一次檢測結(jié)果比較，后三次模型犬的呼吸頻率輕微降低，呼吸幅度略有增大，推測可能是由于動物在進(jìn)行第一次指標(biāo)檢測會出現(xiàn)緊張、不適、應(yīng)激[14]等情況，因此出現(xiàn)呼吸頻率加快、呼吸幅度減小的現(xiàn)象，提示可以通過對動物進(jìn)行多次馴化，提高動物抗干擾能力，以保證呼吸數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

與清醒的模型犬比較，麻醉狀態(tài)下比格犬呼吸頻率降低、呼吸幅度減小，分析可能是由巴比妥類麻醉劑呼吸抑制作用[15]引起的。在本研究中還發(fā)現(xiàn)麻醉犬血壓明顯高于模型犬，究其原因除了與血壓檢測部位不同有關(guān)，還可能與動物的麻醉程度有關(guān)，動物處于淺麻醉狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮，會出現(xiàn)血壓升高和心率加快的情況，反之亦然。QTc間期是用心率校正后的QT間期，是反映心臟去極化和復(fù)極作用的指標(biāo)，QTc間期延長表示心臟復(fù)極延遲，反映了心電異常，通常與心律失常敏感性增高密切相關(guān)，因此QTc間期是評價藥物心臟毒性的重要指標(biāo)。國內(nèi)學(xué)者蔣文燕等[16]將動物麻醉后與麻醉前進(jìn)行自身對照，發(fā)現(xiàn)QT間期在麻醉45 min后明顯延長，在本研究中也發(fā)現(xiàn)麻醉動物的QTc間期明顯大于清醒犬。若用麻醉動物評價藥物心臟毒性，容易對評價結(jié)果產(chǎn)生干擾，產(chǎn)生假陽性，以致誤殺具有研發(fā)價值的受試物。24只模型犬心率平均值為(116.37±25.58) bpm，接近文獻(xiàn)報道值66～130 bpm[17-18]的上限，舒張壓和收縮壓平均值分別為(90.87±14.35)mmHg、(129.72±18.80)mmHg，與國外學(xué)者Nakagawa等[19]采用Telemetry方法所報道結(jié)果基本一致，但是略低于國內(nèi)實驗動物學(xué)教材所列舉的舒張壓和收縮壓的值(100 mmHg、148 mmHg)，分析原因可能是該方法對犬的刺激干擾較小，因此更加接近動物正常生理狀態(tài)下的平穩(wěn)血壓。

VAP模型犬生理遙測系統(tǒng)應(yīng)用于藥物安全性評價具有諸多優(yōu)勢：(1)與傳統(tǒng)的麻醉插管法比較，排除了麻醉藥的干擾和限制，數(shù)據(jù)更接近動物自然狀態(tài)下的數(shù)值，適合多種給藥方式，可較長時間連續(xù)監(jiān)測生理指標(biāo)，洗脫后仍可重復(fù)使用多次，減少了動物的使用，更加符合AAALAC對動物福利的要求，同時也降低了藥物研發(fā)成本；(2)尾套法采集的是外周血壓，屬于間接檢測法，而本方法是直接檢測大動脈的血壓，數(shù)值更加準(zhǔn)確、連續(xù)、穩(wěn)定，在評價降壓藥時具有明顯優(yōu)勢；(3)與DSI植入式遙測法比較， VAP模型犬的植入子更加低廉，較大程度上節(jié)約了研究成本。

目前遙測技術(shù)受到各地方GLP實驗室的青睞，已廣泛應(yīng)用于藥物安全性評價當(dāng)中，然而將VAP植入手術(shù)與遙測技術(shù)相結(jié)合的試驗方式在我國尚無充足的經(jīng)驗可借鑒，因此仍存在一些問題有待進(jìn)一步研究和探索，例如導(dǎo)管植入的深淺、導(dǎo)管在皮下的走形、結(jié)扎線的松緊以及導(dǎo)管內(nèi)的抗凝處理目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。其中導(dǎo)管的抗凝處理是模型成功的關(guān)鍵，抗凝劑量過低，容易引起血栓形成，影響血壓信號的傳輸；抗凝劑量過高，動物凝血功能異常，容易與具有抗凝作用的受試物產(chǎn)生協(xié)同作用，因此不建議將VAP模型犬應(yīng)用于抗凝藥的安全性評價中。

綜上所述，本研究建立的比格犬生理遙測系統(tǒng)數(shù)值穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好、靈敏性高，并且成本低廉、動物利用率高，將其應(yīng)用于藥物安全藥理學(xué)評價中具有可行性。