張 麗 姜樹(shù)勤 吳彩花 周紅霞 王建華

1.邯鄲市傳染病醫(yī)院感染科 (河北 邯鄲， 056002) 2.邯鄲市傳染病醫(yī)院重癥肝病科 3.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

丙型肝炎病毒(HCV)感染是導(dǎo)致肝炎、肝硬化、肝癌發(fā)生的主要原因之一。急性HCV感染通常無(wú)明顯癥狀，60%～80%的急性HCV感染者可發(fā)展為慢性丙型肝炎(CHC)，而其中30%CHC患者可進(jìn)展為肝硬化、肝癌，且肝細(xì)胞癌的發(fā)生率是正常人的20～30倍[1]。干擾素(IFN)-λs是機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染刺激后所分泌的一類具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的特異性細(xì)胞因子。HCV感染后可直接產(chǎn)生IFN-λs并抑制HCV的復(fù)制，IFN-λ3是IFN-λs的III型亞型。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，編碼IFN-λ3的IFNL3(IL28B)基因附近區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與AHC中HCV RNA的缺失相關(guān)，能夠影響HCV治療的反應(yīng)性[2]。本研究調(diào)查了AHC患者HCV感染后血清IFN-λ3水平與HCV RNA含量的變化及其相關(guān)性，并初步分析IFNL3 rs8099917基因多態(tài)性對(duì)血清IFN-λ3水平與HCV RNA含量的影響，為進(jìn)一步揭示AHC疾病的發(fā)生機(jī)制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析邯鄲市傳染病醫(yī)院收治的159例AHC患者(急性感染組)的臨床資料，患者癥狀出現(xiàn)后10天內(nèi)至邯鄲市傳染病醫(yī)院就診。其中男87例，女72例，年齡8～80歲，平均(43.11±10.34)歲。另選擇同期于邯鄲市傳染病醫(yī)院體檢的健康者100例作為對(duì)照組，醫(yī)學(xué)體檢和臨床病史調(diào)查均無(wú)肝臟疾病史，年齡8～80歲，平均(42.09±11.32)歲，其中男56例，女44例。本研究經(jīng)邯鄲市傳染病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)Grebely等人提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平≥400U/L，HCV RNA陽(yáng)性且抗HCV抗體陰性或抗HCV抗體陽(yáng)性在低臨界指數(shù)(<10)；②患者HCV感染不超過(guò)10天；③無(wú)近期自然HCV感染史和治療史；④患者同意接受相應(yīng)HCV治療；⑤所有患者乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒均為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴因感染性、毒性或自身免疫性疾病而導(dǎo)致的其他肝病；②有明確的急性丙肝病史，未經(jīng)任何治療痊愈者；③經(jīng)干擾素及利巴韋林抗病毒治療；④HCV感染或發(fā)病日期不明；⑤妊娠或哺乳期婦女。

1.3 臨床資料及標(biāo)本采集 收集所有受試者臨床醫(yī)學(xué)體檢和其他生化及影像學(xué)檢查資料，包括血常規(guī)、肝功能、甲狀腺功能三項(xiàng)、自身免疫性抗體等。采集受試者入院行體格檢查時(shí)靜脈血5ml，置于4℃待測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 血清IFN-λ3水平檢測(cè) 入院時(shí)收集對(duì)照組與急性感染患者3ml EDTA抗凝血，4℃ 3000r/min離心5min后，采用人血清IFN-λ3 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)檢測(cè)血清IFN-λ3水平，所有操作均嚴(yán)格按照制造商說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 IFNL3 SNP基因分型 采用全血基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich)提取基因組DNA，使用分光光度計(jì)測(cè)量提取DNA濃度，取260/280波長(zhǎng)比為1.7～2.0之間的DNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)焦磷酸測(cè)序儀檢測(cè)IFNL3 SNP位點(diǎn)(rs8099917)。

1.3.3 HCV RNA病毒定量分析 收集研究對(duì)象1.2ml EDTA抗凝血，4℃ 3000r/min離心5min后，采用全自動(dòng)熒光定量PCR儀以及配套試劑進(jìn)行HCV病毒定量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 急性感染組患者和對(duì)照組人員基線資料比較 見(jiàn)表1。

表1 基線資料在兩組人員間的差異

2.2 受試者基線血清IFN-λ3水平與HCV RNA載量比較 見(jiàn)表2。

表2 AHC患者與對(duì)照組基線血清IFN-λ3水平比較

與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3 AHC患者基線血清IFN-λ3水平與HCV RNA的關(guān)系 AHC患者基線血清IFN-λ3水平與基線HCV RNA載量呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 AHC患者血清IFN-λ3水平與基線HCV RNA載量的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4 IFNL3 SNP對(duì)AHC患者基線血清IFN-λ3水平和HCV RNA載量的影響 見(jiàn)表3。

表3 IFNL3 rs8099917對(duì)AHC患者基線血清IFN-λ3水平和HCV RNA載量的影響

2.5 HCV感染后影響HCV RNA載量的危險(xiǎn)因素分析 經(jīng)Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，rs8099917基因型、IFN-λ3均是HCV RNA載量的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 影響HCV RNA載量的多因素分析

3 討論

丙型肝炎作為一種全身性傳染病，能夠?qū)Ω闻K產(chǎn)生持續(xù)性損傷。丙型肝炎的發(fā)生機(jī)制在于HCV感染后，引起病毒血癥，同時(shí)其復(fù)制能夠干擾細(xì)胞內(nèi)大分子的合成，導(dǎo)致溶酶體膜通透性發(fā)生改變，最終引起細(xì)胞病變。急性HCV感染通常無(wú)明顯癥狀，少數(shù)患者會(huì)發(fā)生自發(fā)性清除，但60%～80%的HCV感染是持續(xù)性的，可發(fā)展為CHC，而其中30%CHC患者可進(jìn)展為肝硬化和肝癌。臨床研究證實(shí)，25%以上的急性丙型肝炎患者一般在6個(gè)月內(nèi)能夠自發(fā)清除病毒[4]；此外，針對(duì)急性HCV感染的治療能夠增強(qiáng)病毒的清除[5]。了解自發(fā)性或治療誘導(dǎo)的HCV清除的相關(guān)因素，將改善與AHC早期干預(yù)治療有關(guān)的臨床決策。研究證實(shí)，人類白細(xì)胞抗原、炎癥趨化因子、白細(xì)胞介素、干擾素基因等均與HCV感染有關(guān)，且這些遺傳基因變異可能影響機(jī)體免疫功能，從而影響HCV感染的不同臨床結(jié)局[6]。

IFN-λ3作為III型干擾素，是由IFNL3基因編碼的抗病毒相關(guān)細(xì)胞因子，屬于IFN-λ家族成員之一。IFN-λ主要是在樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)對(duì)病毒蛋白產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生，能夠通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)途徑，誘導(dǎo)STAT1和STAT2磷酸化，并誘導(dǎo)干擾素刺激基因3(ISGF3)復(fù)合物產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)2′,5′-寡腺苷酸合成酶基因家族和MxA蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[7]。肝細(xì)胞、 2型髓系樹(shù)突狀細(xì)胞(mDCs2)和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDCs)均能夠產(chǎn)生響應(yīng)于HCV的IFN-λ。在原代人肝細(xì)胞HCV暴露實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HCV能夠誘導(dǎo)IFN-λ3產(chǎn)生[8]。另外，當(dāng)人mDCs2和pDCs暴露于HCV刺激時(shí)，不僅能夠產(chǎn)生大量IFN-λ3，而且能夠釋放少量IFN-α和IFN-β[9]。小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HCV感染能夠誘導(dǎo)肝臟中IFN-λs基因表達(dá)。研究證實(shí)，IFN-λ3誘導(dǎo)ISGFs作為先天性免疫反應(yīng)中的第一道防線，在抗HCV病毒應(yīng)答反應(yīng)中起非常重要的作用[10]；此外，IFN-λ3能夠抑制HCV復(fù)制，并有效防止HCV擴(kuò)散[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-λ3，IFN-λ3在病毒感染的肝細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)起到特異性抗病毒作用，其表達(dá)水平越高，對(duì)HCV的抑制作用越強(qiáng)。

編碼IFN-λ3的IFNL3(IL28B)基因位于19號(hào)染色體上，包含6個(gè)外顯子。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，IFNL3基因自身及上游的2個(gè)SNPs，rs8099917和rs12979860(有利的等位基因分別為TT和CC)參與影響基于IFN的HCV感染治療療效[12]。Yu等人研究發(fā)現(xiàn)，IFNL3 rs8099917等位基因T的HD受試者自發(fā)性HCV清除率較高[13]。研究表明，IFN-λ3表達(dá)水平和功能的變化可能是由IFNL3 SNP所決定[14]。Thomas發(fā)現(xiàn)，SNP rs12979860與干擾素治療應(yīng)答相關(guān)性最強(qiáng)，攜帶CC基因型的個(gè)體對(duì)治療產(chǎn)生應(yīng)答的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)率是攜帶TT基因型個(gè)體的2倍[15]。Suppiah等人發(fā)現(xiàn)，SNP rs8099917與HCV治療應(yīng)答相關(guān)，攜帶TT和TG基因型個(gè)體的HCV治療應(yīng)答失敗危險(xiǎn)性顯著低于攜帶GG基因型個(gè)體[16]。其中，SNP rs8099917位于IFNL3基因本身上游啟動(dòng)子區(qū)8.9db，而SNP rs12979860位于IFNL4基因的內(nèi)含子1內(nèi)[17]。故本研究主要以 rs8099917作為標(biāo)簽SNP進(jìn)行分析。研究證實(shí)，SNP rs8099917能夠從轉(zhuǎn)錄水平上影響IFNL3表達(dá)，進(jìn)而影響INF-3的表達(dá)和功能[18]。Tanaka[19]和Suppiah等人的研究均發(fā)現(xiàn)，攜帶INFL3 rs8099917 TT保護(hù)性基因型的人群中，血清IFN-λ3 mRNA表達(dá)顯著高于攜帶G危險(xiǎn)等位基因的人群。這表明，IFNL3基因多態(tài)性能夠影響IFN-λ3的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，rs8099917 TT保護(hù)性基因型能夠促進(jìn)IFN-λ3表達(dá)并參與AHC疾病發(fā)生過(guò)程。

研究發(fā)現(xiàn)，rs12979860 C等位基因與較高的基線HCV RNA載量有關(guān)，且這種相關(guān)性只發(fā)生在高病毒裁量的患者中，而在低HCV RNA載量組呈負(fù)相關(guān)[20]。Ikezaki等人也發(fā)現(xiàn)，rs12979860 CC基因型與較高的基線病毒載量有關(guān)[21]。而Rauch等人發(fā)現(xiàn)，IFNL3基因變異與基線HCV RNA載量無(wú)關(guān)[22]。rs8099917位點(diǎn)突變與AHC患者基線HCV RNA載量的關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶IFNL3有利等位基因能夠促進(jìn)IFN-λ3的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞因子對(duì)ISGFs的誘導(dǎo)作用，使ISGFs表達(dá)水平上升，從而增強(qiáng)AHC患者HCV感染后的抗病毒應(yīng)答能力。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，rs8099917基因型、IFN-λ3均是HCV RNA含量的危險(xiǎn)因素，血清IFN-λ3與AHC患者HCV RNA水平密切相關(guān)，并可促進(jìn)疾病發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，急性丙型肝炎患者基線血清IFN-λ3水平的升高與血清HCV RNA載量呈正相關(guān)，IFNL3基因多態(tài)性能夠影響急性HCV感染患者基線IFN-λ3水平。本研究?jī)H討論rs8099917對(duì)IFN-λ3表達(dá)水平的影響，而對(duì)IFN-λ3功能影響的研究還需更深入探究。另外，本研究樣本量較少，后續(xù)研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，以期為IFN-λ3與抗HCV病毒的相關(guān)機(jī)制提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。