劉洪璐，劉梅艷，陸霓虹

（昆明市第三人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，云南 昆明 650041）

肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis，TB） 發(fā)展歷史悠久，嚴(yán)重危害人類的健康和生命，全球分布廣泛。2017年，全球約有1000萬結(jié)核新發(fā)病例，在10萬人中有133例結(jié)核患者。從2011-2016年我國肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)、發(fā)病率均呈逐年緩慢下降趨勢(shì)。我國人口基數(shù)大，是結(jié)核病高發(fā)國家，雖然結(jié)核病防治工作日漸成效，但依舊任重道遠(yuǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國2016年結(jié)核發(fā)病人數(shù)仍有83.6萬，發(fā)病率約為61/10萬[1]，位居世界第三，因此，結(jié)核早期診斷及防治工作尤為重要。

結(jié)核免疫以細(xì)胞免疫為主，結(jié)核桿菌作用于T細(xì)胞使其致敏并釋放出多種淋巴因子如干擾素（Interferon，IFN） 和白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）等[2]，能激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)溶酶體含量增加、酶活性增高，使活化的巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)[3]，對(duì)殺滅原發(fā)灶中的結(jié)核桿菌起著顯著作用。結(jié)核分枝桿菌可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異的T淋巴細(xì)胞可作為檢測(cè)感染的一種新路徑。結(jié)核特異性T細(xì)胞IFN-γ體外釋放試驗(yàn) （T cell-based IFN-γ release assays，IGRA）近年來應(yīng)用廣泛[2]。其原理是通過檢測(cè)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能來判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。人體初次感染結(jié)核分枝桿菌后使T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為記憶T淋巴細(xì)胞，當(dāng)人體再次接觸結(jié)核分枝桿菌后，會(huì)迅速產(chǎn)生效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，釋放以γ-干擾素（IFN-γ）為主的一系列細(xì)胞因子。在機(jī)體外用分枝桿菌特異抗原刺激受試者外周血單個(gè)核細(xì)胞，測(cè)定分離至全血或單個(gè)核細(xì)胞的INF-γ釋放水平，可以判斷是否有MTB感染。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）簡稱斑點(diǎn)試驗(yàn)是常用的一種IGRA。

因此，結(jié)核的發(fā)生與患者的免疫狀況密切相關(guān)，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)亦與機(jī)體免疫相關(guān)，但它們之間的關(guān)系究竟如何，是否能指導(dǎo)臨床早期甄別或定性肺結(jié)核，目前尚未有研究報(bào)道。本研究擬探索肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)、斑點(diǎn)試驗(yàn)與結(jié)核活動(dòng)性之間的相關(guān)關(guān)系，為早期甄別活動(dòng)性肺結(jié)核患者提供臨床依據(jù)和診療策略。

資料與方法一、研究對(duì)象 回顧統(tǒng)計(jì)分析了昆明市第三人民醫(yī)院2018年4月-11月于呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科住院的臨床診斷肺結(jié)核的103例住院患者，其中男性56例，女性47例?；颊吣挲g在13～94歲，中位年齡44歲，青年（＜40歲）44例，中年（40歲～64歲） 36例，老年（≥65歲） 23例。

二、研究方法 患者入院后完善相關(guān)檢查，最終臨床診斷為肺結(jié)核患者或既往感染者?；颊呷朐汉缶M(jìn)行了CT檢查確認(rèn)肺部病變，完善了斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，T細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)等檢查。

三、數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)的表示：正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用中位數(shù)（四分位間距）表示。數(shù)據(jù)之間兩兩比較：正態(tài)分布資料使用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布使用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性比較：兩計(jì)量資料之間的相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，二分類資料之間、二分類資料與計(jì)量資料之間的相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。經(jīng)比較分析，所有數(shù)據(jù)中僅患者CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)、CD4+T細(xì)胞百分比的分布符合正態(tài)分布，其他數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布。

結(jié)果一、斑點(diǎn)試驗(yàn)、活動(dòng)結(jié)合、細(xì)胞免疫之間兩兩相關(guān)性比較

經(jīng)兩兩比較分析，T-SPOT試驗(yàn)抗原A及抗原B 之間顯著相關(guān) （P＜0.001）；CD3+，CD4+，CD8+的T細(xì)胞數(shù)目之間兩兩均有相關(guān)性，P＜0.01。此外，結(jié)核的活動(dòng)性與痰檢陽性率有關(guān)（P＜0.05）；結(jié)核的活動(dòng)性與CD3+T細(xì)胞數(shù)量以及CD4+T細(xì)胞百分比有關(guān)（P＜0.05）；以上各組具體相關(guān)系數(shù)見表1。斑點(diǎn)試驗(yàn)陽性情況（抗原A、抗原B數(shù)量均≤3個(gè)即認(rèn)為斑點(diǎn)試驗(yàn)陰性）、斑點(diǎn)試驗(yàn)抗原A、抗原B具體數(shù)值與細(xì)胞免疫缺乏（T細(xì)胞亞組任意指標(biāo)數(shù)低于正常參考值范圍）、CD3+，CD4+，CD8+具體數(shù)量及百分比均無相關(guān)關(guān)系；結(jié)核活動(dòng)性與斑點(diǎn)試驗(yàn)之間也無相關(guān)關(guān)系。

二、活動(dòng)性肺結(jié)核與陳舊性肺結(jié)核之間的比較

因肺結(jié)核活動(dòng)性與CD3+T細(xì)胞數(shù)目有相關(guān)關(guān)系，按活動(dòng)性肺結(jié)核、陳舊性肺結(jié)核將患者分為2組，其中活動(dòng)性肺結(jié)核有88例，陳舊性肺結(jié)核有15例。CD3+T細(xì)胞在活動(dòng)性肺結(jié)核患者血液中的平均含量為（1004.2±449.6） 個(gè)/μl，在陳舊性肺結(jié)核為（1273.5±477.6） 個(gè)/μl，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者血液中的數(shù)量低于陳舊性肺結(jié)核患者（P＜0.05）；CD4+T%在活動(dòng)性肺結(jié)核患者血液中的平均比率為36.29%±10.7%，在陳舊性肺結(jié)核為43.33%±9.24%，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者血液中的數(shù)量低于陳舊性肺結(jié)核患者（P＜0.05）。其余因素與結(jié)核活動(dòng)性無明顯相關(guān)關(guān)系，具體參數(shù)見表2。

討論肺結(jié)核仍是嚴(yán)重威脅我國人口健康的呼吸道傳染病之一。早期卡介苗的誕生在一定程度上降低了我國結(jié)核的感染率，但隨著耐藥結(jié)核的產(chǎn)生和播散，越來越多的難治性結(jié)核威脅著人們的生命健康。及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷肺結(jié)核患者，做好呼吸道隔離對(duì)降低肺結(jié)核的發(fā)病率、耐藥結(jié)核感染率以及患者死亡率均有重要的意義。

斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)是近年來運(yùn)用較多的結(jié)核相關(guān)檢查之一，在診斷結(jié)核感染方面具有較好的靈敏度和特異性[4]。斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)包括檢測(cè)抗原A及抗原B，抗原A為分泌抗原6（ESAT-6），抗原B為濾液蛋白10（CFP-10），抗原A和抗原B在檢測(cè)過程中分開計(jì)數(shù)，最后根據(jù)陽性斑點(diǎn)數(shù)即可推斷樣本中結(jié)核致敏的T細(xì)胞數(shù)量[5]。本研究也表明抗原A和抗原B的表達(dá)性是一致的，其呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)核分枝桿菌早期分泌ESAT-6和CFP-10在動(dòng)物模型中具有較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫性，是結(jié)核疫苗的候選因子[6]。然而，也有大量證據(jù)表明這些抗原蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染過程中是有毒因子[7]。已有研究表明，ESAT-6通過溶解上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[8]和破壞噬菌體脂質(zhì)體，減少巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，從而抑制抗原呈遞細(xì)胞功能，使MTB及其產(chǎn)物逃逸噬菌體[9]，并促進(jìn)MTB的細(xì)胞內(nèi)傳播[8]。也有研究表明，ESAT-6直接抑制人T細(xì)胞IFN-G的產(chǎn)生[10]。因此，斑點(diǎn)試驗(yàn)抗原A及抗原B與人體免疫狀況有關(guān)，也應(yīng)與T細(xì)胞亞群有一定的關(guān)系。但在本實(shí)驗(yàn)中，通過統(tǒng)計(jì)分析，斑點(diǎn)試驗(yàn)陽性率、抗原A或抗原B數(shù)量與T細(xì)胞亞群各種數(shù)據(jù)間均無明顯相關(guān)關(guān)系，其主要原因考慮與檢驗(yàn)方法有關(guān)。在斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)過程中，收集外周血過濾出其中的免疫細(xì)胞，通過濃集使T細(xì)胞總數(shù)達(dá)到一定數(shù)量后才進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)分析。這種方法對(duì)提高細(xì)胞免疫缺陷患者斑點(diǎn)試驗(yàn)陽性率有較高的幫助，但對(duì)于免疫缺陷患者，原本較少的T細(xì)胞通過濃集，達(dá)到了和免疫正?；颊咄瑯拥臄?shù)量級(jí)，因此免疫缺陷患者和正?；颊叩陌唿c(diǎn)試驗(yàn)并無明顯差異。今后或許可通過收集等量血液，濃縮T細(xì)胞后檢測(cè)抗原A和抗原B含量，這樣的試驗(yàn)方式或許可以發(fā)現(xiàn)其與T細(xì)胞亞群之間的關(guān)系。

表1 斑點(diǎn)試驗(yàn)、活動(dòng)結(jié)合、細(xì)胞免疫之間的關(guān)系指標(biāo)

表2 活動(dòng)性肺結(jié)核與陳舊性肺結(jié)核之間的抗原和淋巴細(xì)胞比較

活動(dòng)性肺結(jié)核與陳舊性肺結(jié)核患者PPD試驗(yàn)與斑點(diǎn)試驗(yàn)常為陽性，CT顯示病灶有時(shí)候也很難區(qū)分是否活動(dòng)。有的活動(dòng)性結(jié)核患者并無典型的結(jié)核中毒癥狀，因此臨床區(qū)分結(jié)核的活動(dòng)性較為困難，直接影響了結(jié)核的治療。而免疫缺陷患者更易感染結(jié)核，因此，本研究從細(xì)胞免疫方面入手分析T細(xì)胞亞群與結(jié)核活動(dòng)性的情況。

T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要的作用，根據(jù)T細(xì)胞表面的生物標(biāo)記T細(xì)胞可以劃分為不同的亞群。幾乎所有成熟的T細(xì)胞表面都有表達(dá)CD3+表達(dá)[11]。Ti/Th細(xì)胞（以CD3+CD4+表達(dá)為特征） 是免疫應(yīng)答中主要的反應(yīng)細(xì)胞，在免疫過程中輔助其他淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞的成熟和細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活。Ts/Tc細(xì)胞（CD3+CD8+）通過結(jié)合主要組織相容性復(fù)合物I類相關(guān)抗原來識(shí)別其目標(biāo)，并破壞病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[12]。CD4+/CD8+比值可直接反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，它們之間既相互促進(jìn)又相制約。因此CD3+T細(xì)胞代表了成熟的T細(xì)胞數(shù)量，CD4+T%即T細(xì)胞中輔助T細(xì)胞的百分比。本研究發(fā)現(xiàn)CD3+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+T%與結(jié)核活動(dòng)性有相關(guān)關(guān)系；在活動(dòng)性肺結(jié)核患者血液中，CD3+T細(xì)胞含量和CD4+T%比率低于陳舊性肺結(jié)核。換言之，成熟T細(xì)胞數(shù)量減少，輔助T細(xì)胞比例減少與結(jié)核的活動(dòng)相關(guān)。在結(jié)核桿菌侵襲人體過程中需要大量的殺傷T細(xì)胞，即CD8+T細(xì)胞參與，因此輔助T細(xì)胞比率相對(duì)減少，符合細(xì)胞免疫過程。但CD8+T%的百分比與結(jié)核活動(dòng)并無負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能有其他作用機(jī)制，或是因樣本量不足導(dǎo)致的。今后可以擴(kuò)大樣本量進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)研究其有無相關(guān)關(guān)系?；蛟S從T細(xì)胞亞組分析方面能幫助我們更準(zhǔn)確快速的判斷患者是否處于結(jié)核活動(dòng)，是否需用藥治療。此外，在本研究中肺結(jié)核活動(dòng)性與痰檢陽性率相關(guān)，這符合活動(dòng)性結(jié)合的診斷，進(jìn)一步證實(shí)本研究的可靠性。

綜上所述，患者CD3+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+T%的細(xì)胞免疫狀況可能與肺結(jié)核的活動(dòng)性有關(guān)，有望作為臨床鑒別結(jié)核活動(dòng)性的參考指標(biāo)。