彭芳芳 魏召新 洪林 楊蕾

摘 ? 要 ?草莓味道甜美、營(yíng)養(yǎng)豐富，還有較高的藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。但草莓病害較多，生產(chǎn)用藥較為頻繁，嚴(yán)重影響了果實(shí)食用安全性。隨著消費(fèi)者的食品安全意識(shí)不斷提高，對(duì)草莓的品質(zhì)也提出了更高的要求。脫毒苗的應(yīng)用滿足了綠色農(nóng)業(yè)及草莓產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展需求，對(duì)產(chǎn)業(yè)興旺起到積極促進(jìn)的作用。從組織培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒、超低溫脫毒等方面綜述草莓脫毒技術(shù)研究進(jìn)展，并提出展望。

關(guān)鍵詞 ? 草莓;組織培養(yǎng)脫毒;熱處理脫毒;超低溫脫毒

中圖分類(lèi)號(hào)：S668.4 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.25.009

近年來(lái)，在發(fā)展特色效益農(nóng)業(yè)政策的引導(dǎo)下，草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展越來(lái)越受到新型農(nóng)業(yè)經(jīng)營(yíng)主體的青睞和重視，草莓種植面積日益擴(kuò)大，隨之而來(lái)的病害發(fā)生日漸頻繁，植株矮化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣等負(fù)面效應(yīng)接踵而至[1]。目前，已報(bào)道的草莓病害有25種之多，造成草莓大幅減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失巨大[2]，其中已查明的4種病毒病嚴(yán)重威脅著草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展：草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病、草莓鑲脈病毒病、草莓皺縮病毒病[3]，植株一旦染病，很難防治。目前，草莓脫毒苗的增產(chǎn)效應(yīng)日益凸顯，與常規(guī)苗相比，脫毒苗的抗病性強(qiáng)、苗株高、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量好、果實(shí)可溶性固形物含量高[4]，因此，培養(yǎng)和推廣脫毒苗是提高草莓產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的必經(jīng)之路。本文圍繞草莓的這4種主要病毒病，從組織培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒及低溫處理脫毒等技術(shù)展開(kāi)綜述。

1 草莓組織培養(yǎng)脫毒

組織培養(yǎng)脫毒是獲取無(wú)毒苗的一條重要途徑，在對(duì)患病草莓有效脫毒的同時(shí)，還可以保持親本的優(yōu)良性狀，提高繁育能力，該技術(shù)已在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用，通常選取莖尖或花粉進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1 草莓莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)脫毒是在無(wú)菌環(huán)境下切取適當(dāng)莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種于最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得無(wú)毒苗的一種方法，莖尖的大小選取直接關(guān)系著培養(yǎng)及脫毒效果，因?yàn)椴《驹跊](méi)有植物維管束的分生區(qū)域內(nèi)，需依靠胞間連絲進(jìn)行傳遞，但由于分生區(qū)域的細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)速度較快，病毒的傳遞速度遠(yuǎn)不及其活躍程度，所以生長(zhǎng)點(diǎn)帶病毒含量極低[5]。同時(shí)，莖尖中內(nèi)源生長(zhǎng)素含量對(duì)病毒增殖起到很好的抑制作用，這也是莖尖被廣泛用于植物組織培養(yǎng)外植體的重要原因[6]。1962—1963年，Belkengren[7]、Miller[8]等人首次采用莖尖培養(yǎng)獲得草莓脫毒苗;1984年，國(guó)內(nèi)鄧明琴等人[9]采用草莓莖尖組織培養(yǎng)獲取無(wú)毒苗取得了初步成效。此后，草莓的莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)便取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。針對(duì)草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓鑲脈病毒、草莓皺縮病毒這4種常見(jiàn)病毒，張志宏等人[10]采用莖尖培養(yǎng)、熱處理、藥劑處理三種脫毒方法，比較評(píng)價(jià)了其脫毒效應(yīng)，結(jié)果表明取0.5 mm莖尖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)是獲得草莓無(wú)毒苗最適宜的辦法，病毒脫除率及分化成苗率均達(dá)到70%以上。楊波等人[11]取0.4 mm莖尖接種于MS培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：組培苗中輕型黃邊病毒和斑駁病毒的脫毒率為100%，鑲脈病毒的脫毒率為82%，表明單純的莖尖培養(yǎng)對(duì)脫毒效果仍有一定的局限。高遐虹等人[12]采用莖尖二次脫毒的方法，4種病毒的脫除率達(dá)100%。莖尖培養(yǎng)及重復(fù)莖尖培養(yǎng)雖然是獲得無(wú)毒苗的有效手段，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、工作效率低的問(wèn)題，探索更高效、更便捷的脫毒方法勢(shì)在必行。

1.2 花藥培養(yǎng)脫毒

花藥培養(yǎng)脫毒是將植物體發(fā)育到一定階段的花藥，接種于適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，形成愈傷組織，從而分化成完整無(wú)毒植株的過(guò)程。有研究表明花藥培養(yǎng)脫毒率之所以能達(dá)到100%，是由于病毒難以到達(dá)花藥等繁殖器官[13]。同時(shí)，花藥培養(yǎng)形成的脫毒苗生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、耐熱能力強(qiáng)、生長(zhǎng)健壯，故花藥組織培養(yǎng)已成為獲得無(wú)毒苗的重要手段[14-15]。1974年，日本大澤勝次[16]首次發(fā)現(xiàn)花藥可培養(yǎng)產(chǎn)生無(wú)病毒植株，這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了花藥培養(yǎng)的“一扇大門(mén)”，此后，花藥培養(yǎng)方法日漸成熟。研究發(fā)現(xiàn)花蕾的大小直接關(guān)系著花藥的發(fā)育情況[17]。一般情況下，草莓花藥單核期為培養(yǎng)的最佳時(shí)期，此時(shí)花蕾直徑約為4 mm，是誘導(dǎo)愈傷組織和分化不定芽的最適宜時(shí)期，誘導(dǎo)率比花粉發(fā)育初雙核期高6倍左右[18]。龍照春等人[19]對(duì)比了莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、幼葉培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)及分化、加熱處理等幾種方式的脫毒效率，發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)脫毒率可達(dá)100%，其愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為L(zhǎng)S+2 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 NAA，誘導(dǎo)率可達(dá)92.8%;不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為L(zhǎng)S+2 mg·L-1 BA+0.3 mg·L-1 NAA，分化率10%;生根培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1 IBA，生根率100%。花藥培養(yǎng)雖在組培脫毒苗應(yīng)用中具有明顯優(yōu)勢(shì)，但花藥再生遺傳變異是一個(gè)客觀存在的問(wèn)題，需要探索一套標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)流程或數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)來(lái)解決[20]。相對(duì)而言，花藥培養(yǎng)再生率較低，在花藥接種前，如將目標(biāo)花蕾離體做低溫處理，花藥愈傷組織出愈率將會(huì)得到顯著提高[21]。研究發(fā)現(xiàn)最適花藥低溫處理時(shí)間為

72 h，出愈率能達(dá)到58%[22]。

2 熱處理脫毒

熱處理脫毒是根據(jù)病毒粒子對(duì)高溫耐受程度的不同，采用不同的處理溫度，使病毒鈍化失活。單純的熱處理脫毒要結(jié)合病毒本身耐受性做適當(dāng)溫度調(diào)整，草莓斑駁病耐熱性較弱，37～38 ℃恒溫處理10～14 d;草莓鑲脈病耐熱性較強(qiáng)，42 ℃處理10～14 d;草莓皺縮病有很強(qiáng)的耐高溫性，38 ℃恒溫處理或35～41 ℃變溫?zé)崽幚頂?shù)周才可以達(dá)到較好脫毒效果 [23]，整體來(lái)看，工作效率較低。1960年下村指出，取0.3 mm以下的莖尖，結(jié)合熱處理方法，將可能達(dá)到100%的脫毒效果，這一發(fā)現(xiàn)克服了單純熱處理脫毒和莖尖脫毒的時(shí)間問(wèn)題和技術(shù)問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)效果。劉健[24]、李志強(qiáng)[25]等人切取40 ℃水浴4 h后的0.3～0.5 mm莖尖進(jìn)行培養(yǎng)后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4種病毒全部脫毒。陳英等人[26]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫處理后，取莖尖長(zhǎng)度為0.2～0.3 mm，脫毒效果較好;當(dāng)莖尖長(zhǎng)度為0.5～0.8 mm時(shí)，僅SVBV病毒未脫除，可能和其耐熱性有關(guān)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，先進(jìn)行莖尖培養(yǎng)后再做熱處理，脫毒率及成活率將顯著提高[28]。

有些學(xué)者將熱處理和低溫處理混合使用，在保證脫毒效果的同時(shí)，進(jìn)一步降低了對(duì)莖尖大小選取的限制，可將莖尖選取范圍擴(kuò)大到1.0～1.5 mm，其再生率和病毒脫除率分別可達(dá)到33%～76%和30%～100%[29]。

3 超低溫脫毒

超低溫脫毒是將植物離體材料預(yù)處理后置于液氮中做冷凍處理，后經(jīng)解凍再生的一種技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)植物脫毒和種質(zhì)資源保存的雙重目標(biāo)。超低溫脫毒的理想材料一般為經(jīng)低溫處理后遺傳性狀較為穩(wěn)定的分生組織、莖尖等[30]。與傳統(tǒng)方法相比，超低溫技術(shù)的脫毒率較高，且不依賴于莖尖大小[31]，有效克服了莖尖培養(yǎng)脫毒的技術(shù)難題[32]。盛宏亞[33]、蔡斌華[34]取1～2 mm帶病草莓莖尖，利用玻璃化超低溫分別在脫除草莓斑駁病毒及草莓輕型黃邊病毒兩類(lèi)單一病毒方面取得較好的效果，脫毒率在95%以上，但該方法的不足之處是存活率較低。羅婭等人[35]探索出了一套既能保證成活率，又能有效脫除病毒的超低溫體系：在0.3 mol·L-1蔗糖溶液中暗培養(yǎng)7 d，室溫下60%PVS2裝載60 min，然后在0 ℃下用100%PVS2玻璃化處理60 min，再用液氮處理1 d后，38～40 ℃水浴2 min，成活率可達(dá)68.89%，病毒脫除率100%。其中，PVS2處理是關(guān)鍵性技術(shù)，處理不當(dāng)將會(huì)嚴(yán)重影響莖尖成活率。在草莓脫毒的整個(gè)過(guò)程中，要經(jīng)歷低溫、滲透、有氧等一系列逆境，可能會(huì)使草莓遺傳信息發(fā)生一定的變化。朱文濤等人[36]采用AFLP和MSAP技術(shù)對(duì)超低溫技術(shù)處理后的草莓做了遺傳穩(wěn)定性研究，AFLP技術(shù)分析說(shuō)明超低溫處理后草莓未發(fā)生遺傳變異，MSAP技術(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)超低溫后草莓DNA甲基化與去甲基化分別為5.70%和12.43%，遺傳穩(wěn)定性受到了一定程度的影響，也有學(xué)者認(rèn)為這可能是一種逆境適應(yīng)表現(xiàn)[37]。

4 展望

草莓病毒病大多為復(fù)合病毒感染，單一應(yīng)用莖尖脫毒、花藥脫毒、熱處理脫毒、超低溫脫毒方法，不能達(dá)到很好的效果，一般情況下會(huì)采取多種方法混合使用，嚴(yán)格來(lái)講，還要注意切取目標(biāo)的大小、時(shí)間、形態(tài)，操作較為繁瑣。而目前，化學(xué)藥劑脫毒、原生質(zhì)體培養(yǎng)脫毒研究相對(duì)較少，在今后的研究中，可進(jìn)行探索性研究，進(jìn)一步拓寬脫毒手段。傳統(tǒng)的方法在操作等方面具有一定的局限性，而植物基因工程的發(fā)展，為草莓品質(zhì)化發(fā)展開(kāi)辟了新天地，例如Katchen Julliany P. Silva[38]等人利用擬南芥模型中發(fā)現(xiàn)的一種被稱為系統(tǒng)獲得抗性（SAR）的自然抗病機(jī)制，將擬南芥NPR1基因（AtNPR1）導(dǎo)入二倍體草莓中，獲得了對(duì)炭疽病、白粉病和角化葉斑病具有抗性的草莓株系。該方法從理論上可選擇多種抗性基因來(lái)抵御各類(lèi)病毒的侵染，發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｍ瑫r(shí)，也可探索通過(guò)注射病毒疫苗來(lái)增強(qiáng)苗木本身對(duì)病毒的免疫能力，從而減少病害的發(fā)生?？傊葺摱驹诩夹g(shù)上雖然取得了一定的進(jìn)展，但是更簡(jiǎn)單、易操作、更長(zhǎng)久的脫毒方法還需要進(jìn)一步探索，脫毒技術(shù)研究工作任重而道遠(yuǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 艾尚杰，張玉連，孫璽如，等.草莓“夢(mèng)”脫毒苗生根和移栽技術(shù)研究[J].種子科技，2018，36（5）：114-115.

[2] 朱海生，花秀鳳，陳敏氡，等.四種草莓病毒SMoV、SVBV、SCV、SMYEV多重RT-PCR檢測(cè)[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（11）：1630-1635.

[3] 楊肖芳，苗立祥，張?jiān)コ?，?浙江省紅顏草莓鑲脈病毒（SVBV）的調(diào)查與莖尖脫毒技術(shù)研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（9）：1694-1700.

[4] 王峰.草莓脫毒苗與常規(guī)苗田間性狀比較試驗(yàn)[J].山西果樹(shù)，2016（2）：10-11.

[5] 金美芳，曹智，蔡俊杰，等.花草莓的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究[J].廣西植物，2017，37（11）：1395-1405.

[6] García-Gonzáles R， Quiroz K， Caligari PDS， et al. Plant tissue culture： current status， opportunities and challenges[J]. Ciencia e Investigación Agraria， 2010，37（3）：5-30.

[7] Belkengren RO， Miller PW. Culture of apical meristems of Fragaria vesca strawberry plants as a method of excluding latent A virus[J]. Plant Disease Report，1962， 46：119-121.

[8] Miller PW， Belkengren RO. Elimination of yellow edge， crinkle， and veinbanding viruses and certain other virus complexes from strawberries by excision and culturing of apical meristems[J]. Plant Disease Report，1963，47：298-300.

[9] 鄧明琴.草莓無(wú)毒苗初報(bào)[J].上海農(nóng)業(yè)科技，1986（4）：3-4.

[10] 張志宏，肖敏，楊洪一，等.草莓病毒脫除方法的比較與評(píng)價(jià)[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2006，23（5）：720-723.

[11] 楊波，趙寶龍，孫軍利，等.草莓新品種京藏香莖尖組培快繁技術(shù)研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018（7）：30-35.

[12] 高遐虹，李梅.提高草莓莖尖組織培養(yǎng)脫毒效率研究[J].中國(guó)果樹(shù)，1994，14（2）：5-6.

[13] 孫崇波，蔣桂華，施季森，等.不同外植體對(duì)草莓病毒脫除效果及病毒的多重RT-PCR檢測(cè)[J] .核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22（4）：447-450.

[14] 薛光榮，楊振英，朱秋英，等.草莓花藥培養(yǎng)獲得無(wú)病毒植株的技術(shù)研究[J].植物學(xué)通報(bào)，1990，7（1）：22-26.

[15] 王永柱，阮利民，呂鵬飛.草莓脫毒組培苗特性及栽培技術(shù)探討[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（5）：664-666.

[16] 大澤勝次.用花藥培養(yǎng)脫毒苗的研究[J].農(nóng)業(yè)與園藝，1974（4）：537-540.

[17] 任建宏，王占明，劉晶，等.草莓“拉松7號(hào)”花藥培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2250-2253.

[18] 杭玲，蘇國(guó)秀，陳麗娟，等.草莓花藥培養(yǎng)再生植株研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（5）：227-229.

[19] 龍照春，郭春華，高慶玉，等.寒地草莓幾種脫毒技術(shù)比較研究[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2014（4）：61-62.

[20] 陳玉波，張學(xué)明，姚環(huán)宇，等.以草莓花藥培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)脫毒的研究進(jìn)展[J].北方果樹(shù)，2016（6）：1-3.

[21] Johansson LB. Effects of activated charcoal， cold treatment and elevated CO2 concentrations on embryogenesis in anther cultures[J]. Acta Horticulturae， 1986， 223：452-456.

[22] 晁慧娟，劉敏，姬謙龍，等.甜查理草莓花藥培養(yǎng)脫毒技術(shù)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25 （2）：18-21.

[23] 王際軒.草莓的病毒病及無(wú)病毒苗繁殖[J].北方果樹(shù)，2011（2）：44-47.

[24] 劉健，劉向蕾，胡繁榮，等.草莓熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒效果的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：1088-1090.

[25] 李志強(qiáng)，王晶，丁國(guó)亮，等.草莓熱處理結(jié)合莖尖脫毒技術(shù)研究[J].北方園藝，2012（5）：125-127.

[26] 陳英，肖春林，羅燕娜，等.紅顏草莓脫毒優(yōu)化及病毒檢測(cè)的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（6）：966-970.

[27] 魏永祥.草莓無(wú)病毒栽培技術(shù)[M].北京：金盾出版社，2007.

[28] 趙海紅.二次莖尖脫毒法對(duì)草莓莖尖培養(yǎng)及脫毒效果的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（5）：15-17.

[29] Zhao L， Wang MR， Cui ZH， et al. Combining thermotherapy with cryotherapy for efficient eradication of apple stem grooving virus from infected In-vitro-cultured apple shoots[J]. Plant disease，2018，102（8）：1574-1580.

[30] QC Wang， Jari PT Valkonen. Cryotherapy of shoot tips： novel pathogen eradication method[J]. Techniques & Applications， 2009，14（3）：119-122.

[31] Feng CH， Wang RR， Li JW. Production of pathogen-free horticultural crops by cryotherapy of In vitro-grown shoot tips[J]. Protocols for Micropropagation of selected， 2013， 110（13）：463-482.

[32] Feng CH， Yin ZY， Ma YL. Cryopreservation of sweet potato （Ipomoea batatas） and its pathogen eradication by cryotherapy[J]. Biotechnology Advances， 2011，29（1）：84-93.

[33] 盛宏亞，萬(wàn)繼花，徐川，等.利用玻璃化超低溫技術(shù)脫除草莓斑駁病毒（SWoV）的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，21（3）：53-57.

[34] 蔡斌華，張計(jì)育，渠慎春，等.通過(guò)玻璃化超低溫處理脫除草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2008，25（6）：872-876.

[35] 羅婭，邱靜，凌亞杰，等.超低溫療法在草莓病毒脫除中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2016，14（9）：2488-2494.

[36] 朱文濤，周厚成，王子成.五葉草莓超低溫保存及遺傳穩(wěn)定性分析[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2013，30（1）：55-61.

[37] Müller J， Day JG， Harding K， et al. Assessing genetic stability of a range of terrestrial microalgae after cryopreservation using amplified fragment length polymorphism （AFLP）[J]. Am J Bot， 2007， 94（5）：799-808.

[38] Katchen Julliany P. Silva， Asha Brunings， Natalia A. Peres， et al. The Arabidopsis NPR1 gene confers broad-spectrum disease resistance in strawberry[J]. Transgenic Research， 2015， 24（4）：693-704.

（責(zé)任編輯：易 ?婧）