鄭耀賢 ［北京師范大學(xué)（珠海）附屬高級中學(xué) 廣東珠海 519080］

小球藻（Chlorellasp.）是一類普生性單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、小球藻屬。小球藻具有生態(tài)分布廣，易于培養(yǎng)，生長速度快等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行生物技術(shù)研究和環(huán)境科學(xué)研究的好材料［1］。著名的卡爾文循環(huán)就是以小球藻為實(shí)驗(yàn)材料，揭示了二氧化碳中的碳在光合作用中轉(zhuǎn)化為有機(jī)碳的途徑。

南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）為菊科蟛蜞菊屬植物，廣泛分布于我國華南地區(qū)及沿海部分地區(qū)，是當(dāng)?shù)匚：?yán)重的區(qū)域性入侵植物之一［2］。南美蟛蜞菊一般生長在道路、水溝、農(nóng)田邊沿和濕潤草地等處,農(nóng)民在清除田埂雜草時(shí)，常將其踩入水田中作為有機(jī)肥，或作為旱地作物的覆蓋綠肥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種肥料對作物有很強(qiáng)的化感作用［3］，常導(dǎo)致作物長勢變差、產(chǎn)量降低等不良癥狀。

化感作用（allelopathy）是指植物通過向環(huán)境釋放特定的次生物質(zhì)從而對鄰近其他植物（含微生物及其自身）生長發(fā)育產(chǎn)生的有益和有害的影響［4］。富營養(yǎng)化水體中藻類大量繁殖，利用植物間的化感作用抑制藻類生長的研究是環(huán)境生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［5］。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 恒溫干燥箱、恒溫光照培養(yǎng)箱、電子天平、恒溫水浴鍋、冰箱、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、移液槍、廣口瓶、錐形瓶、封口膜、紗布、濾紙、蒸餾水等。

1.2 藻種及培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用藻種從校內(nèi)池塘采集后經(jīng)微生物純化培養(yǎng)所得，采用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其組成為（L）：NaNO31.5g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·7H2O 0.036g、Na2CO30.02g、檸檬酸0.006g、檸檬酸鐵0.006g*微量元素溶液A51mL、氨芐青霉素（終濃度）50μg/mL、蒸餾水1000mL。［*微量元素溶液A5：H3BO42.86g、MnCl2·4H2O 1.81g、ZnSO40.222g、Na2MoO40.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co（NO3）2·6H2O 49.4g］

培養(yǎng)條件為（25±1）℃、光照強(qiáng)度為5000lx、連續(xù)光照。

1.3 南美蟛蜞菊根、莖、葉浸提液母液的制取南美蟛蜞菊洗凈自然風(fēng)干后將根、莖、葉分離，分別剪碎，80℃干燥48h，得到根、莖、葉干品，各稱取1g 干品，研磨后分別加入40mL 蒸餾水，100℃水浴加熱30min，過濾定容至50mL，作為實(shí)驗(yàn)?zāi)敢?，其相對濃度都?0g/L，置于廣口瓶，低溫保存。對照組不添加母液，每個(gè)處理重復(fù)3次［6］。

1.4 測量方法

小球藻細(xì)胞密度： 用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡（10×10）下計(jì)數(shù)。

小球藻細(xì)胞抑制率：南美蟛蜞菊根、莖、葉浸提液對小球藻的抑制率計(jì)算公式如下［7］：

［IR 為小球藻細(xì)胞抑制率（%）；N 為處理組細(xì)胞密度；N0為對照組細(xì)胞密度］

2 實(shí)驗(yàn)步驟

1）取處于對數(shù)生長期的小球藻60mL，均分為3份，A、B、C 份各20mL。

2）將A 份小球藻平分為4份分別加入到4個(gè)100mL 錐形瓶中，標(biāo)為A1、A2、A3、A4，再將根浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分別加入A1～A4中；將B 份小球藻平分為4份分別加入到4個(gè)100mL 錐形瓶中，標(biāo)為B1、B2、B3、B4，再將莖浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分別加入B1～B4中；將C 份小球藻平分為4份分別加入到4個(gè)100mL 錐形瓶中，標(biāo)為C1、C2、C3、C4，再將葉浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分別加入C1～C4中。最后分別加入BG-11培養(yǎng)基使培養(yǎng)體系總體積均為50mL。用植物材料的質(zhì)量表示化感物質(zhì)的含量（g/L），分別得到南美蟛蜞菊根、莖、葉濃度梯度為0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L 的化感培養(yǎng)液。

3）將3組共12個(gè)培養(yǎng)體系放到恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)。每隔12h 搖蕩一次，連續(xù)培養(yǎng)7d，每天定時(shí)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行小球藻細(xì)胞密度顯微計(jì)數(shù)，記錄。

4）進(jìn)行3次重復(fù)，采用Excel 整理數(shù)據(jù)，Origin6.5畫曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 南美蟛蜞菊根浸提液對小球藻種群密度的影響 南美蟛蜞菊根浸提液對小球藻種群密度的化感抑制作用比較明顯。如圖1-B，對照組的小球藻種群數(shù)量呈“S”型曲線增長，是典型的邏輯斯蒂增長模型，培養(yǎng)到第7天種群數(shù)量達(dá)到最大值且基本穩(wěn)定。不同濃度的根浸提液處理后小球藻的增長曲線均出現(xiàn)明顯的變形，其中1g/L 和2g/L的處理組種群密度變化曲線接近重疊，且種群數(shù)量均出現(xiàn)下降，這說明1g/L 以上濃度的根浸提液小球藻種群數(shù)量有明顯的抑制作用。由圖1-A，可知不同濃度的根浸提液對小球藻的抑制率隨時(shí)間不斷提高，1g/L 和2g/L 的處理組培養(yǎng)的第7天其抑制率均達(dá)到接近80%，其半效應(yīng)濃度（EC50）出現(xiàn)在第4天。綜合分析，高于1g/L 的根浸提液對小球藻有明顯的抑制效果。

圖1 南美蟛蜞菊根浸提液對小球藻種群密度的影響

3.2 南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻種群密度的影響 南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻種群密度也有明顯的抑制的作用。如圖2-B，0.5g/L 和1g/L的莖浸提液處理小球藻，小球藻種群密度隨時(shí)間依然接近“S”型的增長曲線，其抑制率都接近30%（如圖2-A），說明低濃度的莖浸提液對小球藻種群數(shù)量增長有一定的干擾。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)3天后，0.5g/L 莖浸提液對小球藻的抑制效果比1g/L 的效果略好，這與孔見凡［8］發(fā)現(xiàn)南美蟛蜞菊干莖浸提物對油菜種子萌發(fā)有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增高抑制作用減弱（0～1500mg/L）的結(jié)果一致。說明較低濃度莖浸提液對小球藻的抑制效應(yīng)可能存在不同于葉和根的效應(yīng)，但其機(jī)理尚不清晰，后續(xù)實(shí)驗(yàn)建議可以進(jìn)一步探究0.5g/L 前后的莖浸提液的抑制效果。2g/L 的莖浸提液對小球藻種群密度有顯著的抑制效果，其種群密度隨時(shí)間變化幾乎不增長，其抑制率高達(dá)60%，其半效應(yīng)濃度（EC50）出現(xiàn)在第3～4天。

由圖1和圖2綜合分析認(rèn)為，南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻的抑制作用也比較明顯，但不及根浸提液的抑制效果。若以莖為材料，建議使用2g/L 的莖浸提液處理小球藻。

圖2 南美蟛蜞菊莖浸提液對小球藻種群密度的影響

3.3 南美蟛蜞菊葉浸提液對小球藻種群密度的影響 南美蟛蜞菊葉浸提液在受試濃度范圍內(nèi)對小球藻種群密度的抑制效果不是很明顯。如圖3-B，0.5g/L 和1g/L 的葉浸提液處理小球藻，與對照組的增長曲線幾乎重疊，都呈典型“S”型增長曲線，其中，在培養(yǎng)的前段時(shí)間甚至出現(xiàn)一定的促進(jìn)作用，其促進(jìn)率在5%左右（圖3-A）。2g/L 的葉浸提液對小球藻種群密度有一定的抑制作用，其抑制率最高可達(dá)45%，達(dá)不到半效應(yīng)濃度（EC50），說明2g/L 的葉浸提液對小球藻不會造成明顯的抑制效果，后期建議增大葉浸提液的濃度進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

圖3 南美蟛蜞菊葉浸提液對小球藻種群密度的影響

4 結(jié)論與討論

南美蟛蜞菊的根、莖浸提液對小球藻的種群密度均有明顯的抑制效果，其中根浸提液的抑制效果好于莖浸提液，1g/L 根浸提液對小球藻的抑制率高達(dá)80%。葉浸提液在受試范圍內(nèi)對小球藻的種群密度的抑制效果不明顯，低濃度的葉浸提液對小球藻種群密度還有一定的促進(jìn)作用。

本研究采用小球藻作為實(shí)驗(yàn)材料，開展基于生態(tài)環(huán)境研究的綜合實(shí)踐探究活動(dòng)，有利于發(fā)展學(xué)生的綜合能力，落實(shí)新課程標(biāo)準(zhǔn)“科學(xué)、技術(shù)、社會相互關(guān)系的教育”的教學(xué)建議，發(fā)展學(xué)生的創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力。

開展基于項(xiàng)目的綜合實(shí)踐探究活動(dòng)，學(xué)生在掌握基本技能的同時(shí)，嘗試運(yùn)用種間關(guān)系的視角解決生態(tài)環(huán)境中的實(shí)際問題，極大提升了學(xué)生探究學(xué)習(xí)的興趣。這種基于科學(xué)大概念的學(xué)習(xí)，學(xué)生能感受到知識技能的切實(shí)意義，是指導(dǎo)學(xué)生開展真正學(xué)習(xí)的有效途徑，培養(yǎng)創(chuàng)新性人才的基礎(chǔ)。