江瑞寧 萬苾馨 蘇新華 竇向梅

（北京市十一學校 北京 100039）

河豚魚是我國沿海地區(qū)的傳統(tǒng)美食，但是部分河豚魚有劇毒，食用后會引起中毒甚至死亡［1］。我國水產品管理辦法規(guī)定禁止銷售野生捕撈的河豚魚。但是我國沿海地區(qū)河豚魚資源豐富，大量捕撈的河豚魚通過各種非法途徑混入市場，例如將野生捕撈的河豚魚去除頭和皮，作為其他的魚種銷售，或將河豚魚制成烤魚片等各種魚類制品，進入市場銷售。這些去除形態(tài)學特征的河豚魚，使消費者無法辨認，致使部分消費者誤食有毒河豚魚，從而引起中毒甚至死亡。據不完全統(tǒng)計，2005—2016年間在我國福建、上海、浙江、山東、江蘇等地即發(fā)生了8起因食用烤魚片引起的TTX 中毒事件，造成14人中毒、5人死亡，死亡率高達36%，嚴重危害消費者的健康和生命安全。

傳統(tǒng)的河豚魚鑒定主要依賴魚類樣品外部的形態(tài)特征，不適用于魚類制品中河豚魚成分的鑒定。本研究利用PCR 技術，擴增河豚魚特定靶基因DNA 片段，實現魚類制品中河豚魚成分的鑒定，防止消費者誤食含有河豚魚成分的魚類樣品，保護消費者身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 河豚魚樣品由福建水產研究院提供，并經過專家鑒定。烤魚片樣品采自北京超市。

1.1.2 儀器與試劑 凝膠成像儀（美國Bio-Rad）、DNA 電泳儀（北京市六一儀器廠）、基因擴增儀（美國MJ Research）、高速離心機（德國Eppendorf）、微量可調移液器（德國Brand）、渦旋振蕩器（德國IKA）、電子天平（瑞士Mettler）、微量核酸分析儀（美國NANO200）。

海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒、TAE緩沖液（50×TAE Buffer）、100bp DNA ladder、dNTP Mixture(10mM each)、Gene Red 核酸染料均購自天根生化公司；PCR Nucleotide Mix 和GoTaq Flexi DNA Polymerase 購自Promega 公司。

1.1.3 引物［2］：引物由北京英駿生物技術有限公司合成。

上游引物：5′－CCT ATG GCG TGA AAA ACC AC－3′

下游引物：5′－ACA AGA CCG ACG CTC TGA AT－3′

1.2 方法

1.2.1 河豚魚基因組DNA 提取 按照海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（DP324）說明書提取DNA。100μL TE 洗脫DNA，-20℃保存。

1.2.2 PCR 反應體系的優(yōu)化

1）退火溫度對PCR 反應結果的影響。采用溫度梯度PCR 反應，選擇PCR 反應的最佳退火溫度。溫度范圍設定為42～68℃之間。PCR 反應體系的配制見表1。PCR 反應參數見表2。

表1 PCR 檢測的反應體系

表2 PCR 檢測反應參數

2）鎂離子濃度對PCR 反應結果的影響。在確定了最佳退火溫度后，改變PCR 反應體系（表1）中鎂離子的濃度，使鎂離子的終濃度分別為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L、4.5mmol/L、5.0mmol/L、5.5mmol/L，分別做PCR 反應，確定最佳鎂離子的濃度。

3）DNA 模板對PCR 反應結果的影響。在確定了最佳退火溫度和最佳鎂離子濃度后，改變PCR反應體系（表1）中DNA 模板濃度，依次加入DNA模板量分別為0μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1.0μg 和1.1μg，確定最佳的模板DNA 加入量。

1.2.3 河豚魚成分PCR 鑒定方法與其他魚種的交叉反應 提取市場上常見水產品鯉魚、鯽魚和草魚的DNA，使用河豚魚PCR 鑒定方法進行檢測，觀察河豚魚特異性引物是否與這些魚種有交叉反應。

1.2.4 烤魚片樣品中河豚魚成分檢測 檢測從市場采集的烤魚片樣品中是否存在河豚魚成分。

2 結果

2.1 樣品中DNA 提取效果 按照試劑盒操作步驟，提取樣品DNA，用NANO200儀器測定DNA的純度和濃度（表3）。

表3 河豚魚樣品DNA 提取結果

2.2 退火溫度對PCR 反應結果的影響 從圖1可見，隨著退火溫度的升高，PCR 反應的雜帶逐漸減少，在退火溫度為68℃時，幾乎沒有雜帶出現，所以選擇68℃為最佳退火溫度。

2.3 鎂離子濃度對PCR 反應結果的影響 從圖2可見，當鎂離子的濃度低于2.0mmol/L 時，PCR反應不能正常進行，所以選擇鎂離子的濃度為2.0mmol/L 作為PCR 反應的最佳鎂離子濃度。

圖2 鎂離子濃度對PCR 結果的影響

2.4 DNA 模板濃度對PCR 反應結果的影響 從圖3可見，河豚魚DNA 的模板量達到0.1μg 時，就可以檢測到河豚魚成分。隨著河豚魚DNA 模板量逐漸增加，PCR 擴增出的條帶也逐漸變粗和變亮。

圖3 DNA 模板對PCR 結果的影響

2.5 河豚魚成分PCR 鑒定方法與其他魚種的交叉反應 交叉反應是用本實驗所建立的河豚魚PCR 檢測方法，僅能擴增出河豚魚魚種的DNA 條帶，而不會擴增出其他常見魚種，例如鯉魚、鯽魚等DNA 的條帶，即通過PCR 檢測，如果在800bp附近出現特異的DNA 條帶，則說明一定有河豚魚的DNA。在本實驗中，提取市場上常見水產品鯉魚、鯽魚、青魚和草魚基因組DNA，進行PCR 反應，實驗結果見圖4。從圖4可以看出，僅河豚魚的DNA 在800bp 附近出現DNA 條帶，鯉魚、鯽魚、青魚和草魚則無DNA 條帶出現，說明本方法具有較好的特異性，與鯉魚、鯽魚、青魚和草魚沒有交叉反應。

圖4 河豚魚鑒定PCR 方法特異性研究

2.6 烤魚片樣品的檢測 從市場上隨機購買烤魚片樣品3份，用PCR 方法進行檢測，以河豚魚樣品DNA 作為陽性對照，以水作為陰性對照。電泳結果見圖5。

圖5 烤魚片樣品中河豚魚成分檢測

3 討論

3.1 PCR 最佳反應條件的選擇 退火溫度對PCR 結果有影響。退火溫度越低，PCR 的非特異性擴增就越多，反之，提高退火溫度，可以有效降低非特異性擴增條帶的出現，結果的特異性就越好。在本實驗中，為了保證較好的檢測結果，選擇PCR 的退火溫度為68℃。

鎂離子是PCR 反應必須的，低濃度的鎂離子不能激活Taq 酶（DNA 聚合酶），PCR 反應不能正常進行，當鎂離子達到一定濃度時，才能有效地催化Taq 酶，使PCR 反應順利進行。本研究中，當鎂離子濃度大于2.0mmol/L，才能使PCR 反應順利進行。

模板DNA 的量對PCR 結果也有影響。適當增加模板DNA 的量，可以使電泳結果更加清晰。

本實驗經過3批次重復，河豚魚樣品的DNA 均在800bp 左右出現相應電泳條帶，實驗結果穩(wěn)定。

3.2 河豚魚特異性靶基因的選擇 應用分子標記和分子分類系統(tǒng)對物種進行研究的想法要追溯到1993年［3］。2002年Tautz 等首先提出DNA 分類的概念，即以DNA 為基礎建立物種識別體系。2004年，Hebert 等提出利用線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）的基因序列作為物種鑒定的靶基因［4-5］。隨后Ward 等應用COⅠ基因序列對澳大利亞270種海洋魚類進行研究，結果顯示種內平均差異為0.39%，屬內的種間平均差異9.93%，科內的種間平均差異15.5%，而目內的種間平均差異增加到22.2%～23.3%，實驗證明COⅠ可以成功地對魚類進行鑒定［6］。因此，本研究選擇了河豚魚線粒體細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ（COⅠ）的一段長約810bp 的序列作為河豚魚鑒定的靶基因。

3.3 關于樣品檢測 本研究檢測的3份烤魚片樣品，沒有檢出河豚魚成分。這次檢測的樣品數量較少，后續(xù)應檢測更多的樣品驗證這種方法。由烤魚片引起的河豚毒素中毒，在我國時有發(fā)生，主要是在制作烤魚片的過程中混入了有毒的河豚魚，致使消費者誤食河豚魚，引起中毒反應［7］。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法無法滿足烤魚片中河豚魚成分的鑒定，因此，本研究嘗試利用PCR 方法，針對河豚魚特異性靶基因進行檢測，鑒定烤魚片中是否含有河豚魚成分，防止消費者誤食河豚魚引起中毒反應，這種方法是可行的。