朱翔鴻,3 楊貞 錢穎 李松濤 竇曉兵

1.浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學分子醫(yī)學研究所

3.浙江中醫(yī)藥大學濱江學院 4.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院

5.浙江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院、公共衛(wèi)生學院

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已逐漸成為全球慢性肝病的首要原因，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD進展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，全球約有24%的成人患NAFLD，其中大約25%為NASH[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是 NAFLD 進展為 NASH的主要影響因素之一，其通過促進肝臟巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和其他炎癥因子[3]，從而促進NASH的發(fā)生發(fā)展。

目前中醫(yī)藥已成為治療NASH的重要選擇之一，在降低炎癥指標水平、維持機體內(nèi)環(huán)境平衡方面具有明顯的優(yōu)勢[4]。扶正化瘀的中藥復方具有益精養(yǎng)肝扶正、活血化瘀的功效[5]，常被用于NAFLD/NASH的臨床治療。扶正化瘀復方中五味子主要發(fā)揮保肝解毒的作用，而五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是五味子的主要成分，研究證實其具有抗炎、抗腫瘤、清除自由基等作用[6]，但Sch B對NAFLD/NASH的作用尚不明確，本研究通過LPS誘導建立小鼠巨噬細胞炎癥損傷模型，探究Sch B對LPS誘導的巨噬細胞炎癥損傷的影響及其相關(guān)分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW 264.7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 主要試劑和儀器 Sch B、Toll樣受體 4（Toll like receptor 4,TLR4）抑制劑、DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）購于 Sigma公司（批號：61281、614316、D5796、11465007001）；胎牛血清購于Biological Industries公司（批號：04-001-1ACS）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購于Thermo公司（批號：TR20015）；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購于普利萊公司（批號：P1511）；TNF-α、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司（批號：EK0527、EK0411）；所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。酶標儀購于美國MD公司；7500 Fast熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和分組 RAW 264.7細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞接種于24孔板，待細胞密度達到70%對細胞進行藥物處理。設(shè)置空白對照組、不同濃度Sch B組和TLR4抑制劑組，分別以25、50、100μmol·L-1Sch B 或 0.4μg·mL-1TLR4 抑制劑預處理細胞2h，而后加入LPS干預8h。

1.3.2 細胞損傷檢測 細胞分組及藥物處理方案同1.3.1，各給藥組分別收集細胞培養(yǎng)基10μL加入96孔板中，再加入LDH工作液40μL，37℃孵育30min，加入終止液50μL，酶標儀于440nm處檢測吸光度（optical density，OD）值，細胞的損傷程度以各給藥組與空白對照組OD值的比值表示。

1.3.3 MTT檢測細胞存活率 收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔板中，細胞分組及藥物處理方案同1.3.1，棄去培養(yǎng)基，向96孔板中加入MTT溶液，孵育4h后棄去上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）并振蕩充分溶解，酶標儀于570nm處檢測OD值，計算細胞存活率。

1.3.4 炎癥因子測定 細胞分組及藥物處理方案同1.3.1，棄去培養(yǎng)基，以PBS漂洗后加入RIPA裂解液，冰上孵育30min，收集細胞裂解液放入Ep管中，以ELISA試劑盒檢測細胞質(zhì)中TNF-α、IL-6含量，并以BCA試劑盒檢測蛋白濃度校準。

1.3.5 熒光定量PCR檢測TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88） 和 TNF-α的mRNA表達 收集細胞，以PBS漂洗3次后用Trizol法提取細胞總RNA，于4℃下12 000r/min離心5min，棄去上清液后至通風櫥中干燥，將總RNA溶于適量預冷DEPC水中，測定RNA濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表達并以β-actin為內(nèi)參進行校正。引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較，先進行方差齊性檢驗，方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊則單獨分離采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導炎癥損傷模型建立 分別以25、50、100ng·mL-1LPS 干預 8h 后，與空白對照組（0ng·mL-1）比較，結(jié)果提示，100ng·mL-1LPS干預后，細胞培養(yǎng)基中LDH水平和細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α含量均顯著增加（P＜0.05）。見圖1。表明LPS可以誘導細胞炎癥反應(yīng)及細胞損傷，在后續(xù)研究中選擇100ng·mL-1的LPS作為炎癥損傷的誘導劑量。

圖1 LPS誘導細胞損傷Fig.1 LPS induced cell injury

2.2 各組細胞損傷和細胞存活率比較 分別采用0.4μg·mL-1TLR4 抑制劑和 25、50μmol·L-1Sch B 預處理細胞2h，再以100ng·mL-1LPS干預8h，檢測培養(yǎng)基中LDH水平，結(jié)果表明LPS導致LDH水平升高，細胞存活率下降（P＜0.05），而高濃度的Sch B能顯著減輕LPS誘導的細胞損傷（P＜0.05）。見圖2A。MTT檢測提示，LPS導致細胞存活率下降（P＜0.05），高濃度的Sch B能夠提高細胞存活率（P＜0.05）。見圖2B。

圖2 各組細胞損傷和細胞存活率比較Fig.2 Comparison of cell injury and cell survival rate in each group

2.3 各組細胞炎癥因子含量比較 分別采用0.4μg·mL-1TLR4 抑制劑和 25、50、100μmol·L-1Sch B 預處理細胞2h，然后以LPS干預8h。ELISA檢測提示，LPS誘導細胞內(nèi) TNF-α、IL-6含量上調(diào)（P＜0.05），而Sch B 能下調(diào) TNF-α、IL-6的含量（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 各組細胞炎癥因子含量比較Fig.3 Comparison of content of inflammatory cytokines in each group

2.4 各組細胞TLR4-MyD88信號通路基因表達比較分別采用 0.4μg·mL-1TLR4 抑制劑和 25、50、100μmol·L-1Sch B 預處理細胞 2h，然后以 LPS 干預8h。熒光定量PCR檢測提示，LPS能夠提升TLR4、MyD88、TNF-α 的 mRNA 表達水平（P＜0.05），而 Sch B能顯著下調(diào) TLR4、MyD88、TNF-α的 mRNA 表達水平（P＜0.05），且與劑量相關(guān)。見圖4。

圖4 各組細胞TLR4-MyD88信號通路基因表達比較Fig.4 Comparison of gene expression of TLR4-MyD88 signaling pathway in each group

3 討論

中醫(yī)認為，NAFLD的疾病表現(xiàn)虛實夾雜，應(yīng)以防為先，在扶正化瘀的基礎(chǔ)上綜合用藥，而NAFLD/NASH其關(guān)鍵病機在于正氣不足、熱毒內(nèi)陷、癖熱互結(jié)，虛、熱、癖是本病發(fā)生發(fā)展的主要病機基礎(chǔ)[7]，預防之時當以益氣養(yǎng)陰、活血祛癖為主。扶正化瘀復方由丹參、絞股藍、桃仁、松花粉、蟲草菌絲、五味子6味中藥組成，Sch B是方劑中五味子的主要活性成分，具有抑制炎癥和抗氧化的作用[5]，但是其具體作用機制尚不清楚，因此本研究建立了LPS誘導的細胞炎癥損傷模型，探究Sch B對LPS誘導的細胞炎癥損傷的影響及其相關(guān)分子機制。結(jié)果顯示，Sch B能夠顯著改善細胞損傷，并降低炎癥因子的表達。

研究證實，LPS能夠激活TLR4，導致機體產(chǎn)生強烈免疫反應(yīng)，在機體免疫和炎癥發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用，但過度免疫不利于機體修復[8]。TLR4通過激活MyD88依賴性途徑，可誘導核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達，從而促進炎癥因子 TNF-α、IL-6等的分泌[9]，并大量釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS），進一步加重炎癥反應(yīng)，引起肝臟細胞損傷[10]?，F(xiàn)有研究表明，TLR4-MyD88信號通路是改善細胞炎癥的有效途徑，MyD88作為TLR4最主要的下游信號分子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用，通過抑制TLR4-MyD88信號通路能減輕LPS誘導的細胞炎癥反應(yīng)[11]。在本研究中通過TLR4抑制劑同樣證實了這個結(jié)論。本研究還發(fā)現(xiàn)，LPS能夠增加細胞炎癥因子釋放，而Sch B能顯著抑制LPS的作用，Sch B還能夠抑制TLR4及其下游基因MyD88的表達，因此筆者推測Sch B能夠通過抑制TLR4-MyD88信號通路發(fā)揮其對細胞炎癥損傷的保護作用。

綜上所述，LPS通過TLR4-MyD88依賴的機制誘導小鼠巨噬細胞損傷，而Sch B通過調(diào)控TLR4-MyD88信號通路抑制LPS誘導的炎癥因子表達，從而減輕LPS誘導的細胞損傷。本研究結(jié)果初步提示，Sch B可能作為防治NASH的潛在藥物。