趙城彬，尹歡歡，劉景圣，許秀穎，張 浩，吳玉柱，曹 勇，齊寶坤*，吳 非*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

紅豆又叫紅小豆、赤豆等，是我國(guó)重要的豆科植物，在我國(guó)種植和利用已有2 000多年的歷史。作為淀粉質(zhì)豆類，紅豆中含有豐富的膳食纖維和一定量的鈣、磷、鐵以及B族維生素等。其中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為41.83%～59.89%，其次為蛋白質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.33%～29.2%，氨基酸種類齊全且組成均衡，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)豆類蛋白資源[1]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）是一種由一個(gè)多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中含有331 個(gè)氨基酸。TG是一種對(duì)Ca2+不敏感的有益酶，并能在寬泛的pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用。TG可使許多蛋白質(zhì)系統(tǒng)形成異肽鍵并發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，這些異肽鍵的形成表明TG處理可以修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改變，甚至使蛋白質(zhì)產(chǎn)生新特性[2]。Hwang等[3]研究表明紅豆蛋白含有大量的賴氨酸，通過TG交聯(lián)能夠形成ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸異肽鍵，利于改善蛋白質(zhì)的乳液性質(zhì)和凝膠的溶解度。

蛋白質(zhì)的適當(dāng)變性可以促進(jìn)蛋白質(zhì)對(duì)TG的敏感性，通過熱處理或添加亞硫酸氫鹽等還原劑使蛋白質(zhì)變性可以增強(qiáng)TG催化蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)反應(yīng)[4]。近年來，超聲技術(shù)由于具有空化效應(yīng)、剪切作用以及湍流作用，廣泛應(yīng)用于食品蛋白的加工中，并成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。何秋實(shí)[5]研究超聲處理對(duì)紅豆蛋白功能性質(zhì)影響，并采用拉曼光譜分析了紅豆蛋白結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠修飾紅豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，改善蛋白質(zhì)溶解性、表面疏水性和乳化性。Xiong Ting等[6]發(fā)現(xiàn)采用低頻（20 kHz）超聲處理30 min能夠引起豌豆蛋白的適當(dāng)變性，誘導(dǎo)蛋白分子部分展開，同時(shí)改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。超聲引起蛋白質(zhì)變性的效率高，可為促進(jìn)TG交聯(lián)蛋白質(zhì)提供可能，且在常溫下就能實(shí)現(xiàn)，避免高溫和化學(xué)變性劑對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生不利影響。目前，對(duì)紅豆蛋白的研究均是采用單獨(dú)超聲處理或單獨(dú)TG處理，鮮見關(guān)于超聲-TG聯(lián)合作用于紅豆蛋白結(jié)構(gòu)修飾及功能性質(zhì)改善的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)的目的是考察超聲是否能夠改變紅豆蛋白的致密結(jié)構(gòu)，并提高蛋白質(zhì)對(duì)TG的敏感性，從而促進(jìn)TG對(duì)蛋白質(zhì)的修飾和功能性質(zhì)的改善作用。采用超聲-TG聯(lián)合處理紅豆蛋白，對(duì)其乳化性、發(fā)泡性和凝膠性進(jìn)行研究，并分析其表面疏水性、游離巰基含量、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）和熱特性，以期探究其結(jié)構(gòu)修飾與功能性質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系，為研發(fā)高功能性紅豆蛋白及闡明其相關(guān)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆品種為‘白紅11號(hào)’（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.59%、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)56.82%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.74%、纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.98%、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.12%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.43%），購(gòu)自吉林省白城市。

TG、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS）、溴化鉀 美國(guó)Sigma公司；5,5’-二巰基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 青島捷世康生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2D超聲探頭發(fā)生器 寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Alpha1-4LDplus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；DU800型紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；臺(tái)式掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom公司；TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；VERTEX 70 FTIR儀德國(guó)Bruker公司；PE Pyris 6差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國(guó)TA公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆分離蛋白的制備

將紅豆60 ℃烘干后脫皮，然后粉碎過60 目篩，采用正己烷以4∶1（m/V）的比例對(duì)紅豆粉進(jìn)行脫脂3 h，6 000×g離心20 min后，將沉淀風(fēng)干得到脫脂紅豆粉。將脫脂紅豆粉與蒸餾水以1∶10（m/V）的比例混合，采用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.5，在50 ℃下攪拌提取2 h，然后在6 000×g條件下離心20 min，采用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5，然后以同樣的條件離心，取沉淀水洗3 次，將沉淀復(fù)溶后調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后冷凍干燥即得紅豆分離蛋白（red bean protein isolate，RBPI）。采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到RBPI中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.86%。

1.3.2 超聲-TG處理RBPI

將適量的RBPI溶解于蒸餾水中，室溫下攪拌2 h，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的蛋白溶液。實(shí)驗(yàn)分為單獨(dú)超聲（US）處理組和超聲-TG（US-TG）組，對(duì)于US處理組：采用400 W、20 kHz條件下進(jìn)行超聲處理0、5、10 min，超聲處理采用間歇式（超聲2 s、間歇4 s），且樣品置于冰浴中，保持溫度為25～30 ℃。對(duì)于US-TG處理組：向超聲處理后的蛋白溶液中添加20 U/g TG，1 000 r/min攪拌2 min確保酶在樣品中均勻分散。將樣品分為兩部分，一部分在40 ℃下反應(yīng)2 h，冷凍干燥，用于乳化性、發(fā)泡性及結(jié)構(gòu)測(cè)定；另一部分在40 ℃下反應(yīng)6 h，4 ℃冷藏過夜，用于凝膠微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)分析。對(duì)照組為未經(jīng)超聲及TG處理的RBPI，其他處理與實(shí)驗(yàn)組樣品相同。

1.3.3 乳化性測(cè)定

將蛋白樣品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。以1∶3的體積比添加大豆油，于22 000 r/min下均質(zhì)2 min，分別在0 min和10 min時(shí)，從測(cè)試管底部取樣50 μL，用0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋100 倍，測(cè)定500 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以0.1 g/100 mL SDS溶液為空白。乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）的計(jì)算分別見公式（1）、（2）。

式中：D為稀釋倍數(shù)（100）；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL），φ為比色皿光程（1 cm）；θ為乳液中油相所占比例（0.25），A0和A10分別為0 min和10 min時(shí)的吸光度。

1.3.4 發(fā)泡性測(cè)定

將蛋白樣品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制成1 g/100 mL的蛋白溶液，在10 000 r/min下均質(zhì)5 min，立即記錄泡沫體積V0/mL。靜置30 min后，再次記錄泡沫體積V30/mL。發(fā)泡能力（foaming capacity，F(xiàn)C）及泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）計(jì)算分別見公式（3）、（4）

式中：Vs為樣品溶液體積/mL。

1.3.5 凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察凝膠樣品的微觀結(jié)構(gòu)。參照Xu Xiuying等[7]的方法，取一定量凝膠樣品放于離心管中，迅速液氮冷凍，然后冷凍干燥脫水。將凍干樣品置于鋁箔上，用雙面膠碳帶固定，然后離子濺射噴金，置于掃描電子顯微鏡觀察臺(tái)上進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。設(shè)置加速電壓為5 kV，放大500 倍。

1.3.6 凝膠質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

采用TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測(cè)定。首先將凝膠樣品在室溫下靜置一定時(shí)間，然后將樣品放于測(cè)量臺(tái)上，采用P/0.5的探頭進(jìn)行測(cè)定，模式選擇TPA模式，設(shè)置壓縮前速率3.0 mm/s，壓縮中速率2.0 mm/s，壓縮后速率3.0 mm/s，凝膠壓縮比例為30%，兩次下壓間隔5 s，觸發(fā)力為5 g。記錄凝膠的硬度和黏附力。

1.3.7 凝膠脫水收縮作用測(cè)定

將凝膠樣品（質(zhì)量為mt/g）在室溫下靜置10 min以達(dá)到溫度平衡，然后在室溫下以5 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定其質(zhì)量（ms/g），并計(jì)算脫水收縮作用（公式（5））。

1.3.8 表面疏水性和游離巰基含量測(cè)定

蛋白質(zhì)表面疏水性通過疏水熒光探針ANS測(cè)定，熒光激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 nm和470 nm。蛋白樣品溶液質(zhì)量濃度為0.05～1.00 mg/mL，取8 mmol/L ANS溶液40 μL添加到4 mL的蛋白溶液中，混勻后測(cè)定熒光強(qiáng)度，蛋白質(zhì)表面疏水性用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度的斜率表示。

游離巰基含量采用Ellman’s試劑（10 mmol/L DTNB）測(cè)定，吸光度采用紫外-可見分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，游離巰基含量采用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算，以每克蛋白質(zhì)中含有的巰基物質(zhì)的量表示，單位為μmol/g。

1.3.9 FTIR測(cè)定

參照Zhao Chengbin等[8]的方法進(jìn)行FTIR測(cè)定，將0.1 mg蛋白樣品與4 mg溴化鉀用研缽充分研磨成均勻粉末，壓制成薄片，然后進(jìn)行全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm-1，測(cè)定溫度為25 ℃。采用紅外光譜圖分析軟件Peak Fit 4.12對(duì)圖譜的酰胺I帶1 700～1 600 cm-1進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.10 熱特性測(cè)定

參考趙城彬等[9]的方法，樣品的熱特性通過DSC儀測(cè)定。取3 mg蛋白樣品于鋁盤中，壓片并以空鋁盤為對(duì)照。以5 ℃/min的升溫速率由20 ℃升至120 ℃，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。記錄此過程的起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Te）和熱焓變（ΔH）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin 8.0軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)RBPI乳化性的影響

圖1 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理對(duì)RBPI乳化性的影響Fig. 1 Effect of US-TG treatment on emulsifying properties of RBPI

如圖1所示，超聲和TG均對(duì)乳化活性具有很大的影響。與對(duì)照相比，超聲處理5 min能夠使RBPI的乳化活性顯著增加（P＜0.05），而超聲處理10 min會(huì)使RBPI的乳化活性稍有降低，但影響不顯著（P＞0.05）。短時(shí)間超聲處理能夠使蛋白質(zhì)部分展開，分子柔順性增加，同時(shí)促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，利于乳化活性的改善；然而長(zhǎng)時(shí)間超聲處理會(huì)使水相中的蛋白質(zhì)聚集，導(dǎo)致體系的乳化活性降低。Chandrapala等[10]也報(bào)道了超聲處理α-乳白蛋白和β-乳球蛋白混合物能夠提高蛋白質(zhì)聚集，降低表面疏水性，從而影響其乳化性能。TG能夠使RBPI的乳化活性提高，這是由于TG催化蛋白質(zhì)相互交聯(lián)，促進(jìn)了蛋白粒子的兩親特性，并且增強(qiáng)了肽鏈-脂肪相互作用。因此，肽鏈更容易被吸附在水-脂肪界面上，導(dǎo)致乳化活性增強(qiáng)。在多肽形成過程中引起的靜電排斥可能防止蛋白質(zhì)積聚，從而減少蛋白質(zhì)聚集[11]。Anuradha等[12]報(bào)道了TG處理β-乳球蛋白能使蛋白質(zhì)乳化活性提高約30%。然而，超聲-TG聯(lián)合處理能夠使RBPI的乳化活性進(jìn)一步提高，這可能是因?yàn)槌曁幚硎筊BPI的分子鏈展開，暴露出更多的基團(tuán)，導(dǎo)致TG交聯(lián)蛋白質(zhì)的能力提高。

無論是否添加TG，超聲處理對(duì)乳液穩(wěn)定性均沒有顯著影響（P＞0.05），而TG處理的RBPI乳化穩(wěn)定性顯著提高（P＜0.05）。Fraergemand等[13]也得到了相似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)TG處理的β-乳球蛋白與天然β-乳球蛋白形成的乳液相比，穩(wěn)定性得到了改善。TG處理形成異肽鍵可能是改善蛋白質(zhì)乳液穩(wěn)定性的原因，如泡沫和乳液的穩(wěn)定性。

2.2 不同處理對(duì)RBPI發(fā)泡性的影響

圖2 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理對(duì)RBPI發(fā)泡性的影響Fig. 2 Effect of US-TG treatment on foaming properties of RBPI

由圖2可知，超聲處理顯著提高了RBPI的發(fā)泡能力（P＜0.05），且超聲處理10 min的發(fā)泡能力顯著高于超聲處理5 min的樣品。由此可以推斷，超聲通過均質(zhì)化作用使脂肪和蛋白顆粒在溶液中分布得更加均勻，從而對(duì)樣品發(fā)泡能力具有積極作用。此外，超聲處理能夠使蛋白分子尺寸減小，這利于蛋白質(zhì)發(fā)泡能力的改善[14]。Jambrak等[15]報(bào)道了采用20 kHz和40 kHz的高強(qiáng)度超聲處理15 min，乳清分離蛋白的發(fā)泡能力由132%分別增加至235%和220%。此外，還有研究也發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度（20 kHz和40 kHz）超聲對(duì)α-乳白蛋白同樣具有類似的影響，而低強(qiáng)度超聲卻不能改善樣品的發(fā)泡特性[5]。相反，TG的添加會(huì)破壞乳清蛋白的發(fā)泡能力。蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力與它在空氣-水界面上形成一層薄而堅(jiān)固的液膜能力有關(guān)，并影響膜內(nèi)氣泡的形成[14]。TG降低發(fā)泡能力的一個(gè)合理解釋是，TG的添加增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的交聯(lián)和黏度，使蛋白質(zhì)顆粒失去了吸附在空氣-水界面上的能力，從而抑制泡沫的形成。此外，與TG相比，超聲-TG聯(lián)合處理使RBPI的發(fā)泡能力進(jìn)一步降低。

泡沫穩(wěn)定性也受超聲和TG處理的影響。超聲處理會(huì)降低樣品的泡沫穩(wěn)定性，超聲處理10 min的樣品與其他樣品相比泡沫穩(wěn)定性下降，但在整個(gè)超聲處理過程中沒有顯著性變化（P＞0.05）。然而，Jambrak等[15]發(fā)現(xiàn)400 W、20 kHz超聲處理15 min對(duì)乳清分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性具有積極的作用，使泡沫穩(wěn)定性由68.3 min增加至98.4 min。Tan等[16]也發(fā)現(xiàn)隨著超聲振幅的增加和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，乳清蛋白泡沫析水減少。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果之間存在差異，這可能是植物蛋白（紅豆蛋白）和動(dòng)物蛋白（乳清蛋白）性質(zhì)不同以及超聲處理?xiàng)l件的不同等多方面因素的結(jié)果。TG對(duì)發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響是相反的。TG處理破壞了樣品的發(fā)泡能力，卻形成了更穩(wěn)定的泡沫。這說明發(fā)揮蛋白質(zhì)交聯(lián)作用的共價(jià)鍵作為發(fā)泡能力的不良因素似乎是泡沫穩(wěn)定性的促進(jìn)劑。Agyare等[17]也報(bào)道了在不同pH值水平下，TG處理的小麥谷蛋白水解物的發(fā)泡能力與泡沫穩(wěn)定性之間成反比關(guān)系。此外，超聲10 min聯(lián)合TG處理使RBPI的泡沫穩(wěn)定性得到顯著提高（P＜0.05），這也說明了TG處理蛋白質(zhì)之前的超聲處理能夠提高蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度，從而改善泡沫穩(wěn)定性。

2.3 不同處理對(duì)RBPI凝膠性質(zhì)的影響

2.3.1 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

許多學(xué)者對(duì)TG誘導(dǎo)的各種蛋白質(zhì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)做了大量研究[18]，因此，本實(shí)驗(yàn)探究了超聲和TG聯(lián)合作用對(duì)RBPI凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響。如圖3所示，未經(jīng)超聲處理的條件下，TG誘導(dǎo)的RBPI凝膠具有松散片狀的微觀結(jié)構(gòu)，在蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中具有較大的孔隙，更少的交聯(lián)，更不均勻的結(jié)構(gòu)（圖3A）。超聲和TG的聯(lián)合處理對(duì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)具有很大的影響（圖3B、C）。超聲處理可使TG誘導(dǎo)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更加均勻致密，且孔隙度更小，超聲處理5 min聯(lián)合TG誘導(dǎo)的凝膠樣品與其他樣品相比微觀結(jié)構(gòu)更加均勻。Zhao等[19]也報(bào)道了山羊奶經(jīng)超聲處理后凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，他們指出，超聲預(yù)處理可以使山羊奶形成更緊湊的凝膠結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致孔隙更小。Riener等[20]在超聲處理的酸奶凝膠中也得到了同樣的結(jié)果，即超聲處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)超聲的空化效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白分子部分展開并暴露出活性基團(tuán)[21]，這可能會(huì)促進(jìn)TG催化的交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凝膠微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異。

圖3 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的RBPI凝膠掃描電子顯微鏡圖（×500）Fig. 3 Scanning electron microscope (SEM) images of RBPI gel induced by US-TG treatment (× 500)

2.3.2 凝膠質(zhì)構(gòu)特性和脫水收縮作用

超聲和TG處理對(duì)組分之間的相互關(guān)系和結(jié)構(gòu)性質(zhì)均具有重要影響，因此兩者聯(lián)合作用能夠改善蛋白質(zhì)凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。如表1所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的RBPI溶液經(jīng)過TG處理能夠形成具有一定硬度（965.9 g）和黏附力（11.65 g·s）的凝膠。Gauche等[22]研究發(fā)現(xiàn)向乳清蛋白中添加TG可以改善凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，其硬度和黏附力均得到改善。超聲處理能夠使TG誘導(dǎo)的RBPI凝膠硬度和黏附力增加。Frydenberg等[23]也報(bào)道了超聲處理對(duì)乳清蛋白凝膠的硬度具有相似的影響，他們發(fā)現(xiàn)由于二硫鍵含量的增加，非熱條件下的超聲處理顯著提高了蛋白質(zhì)的凝膠硬度。然而，當(dāng)超聲處理達(dá)到10 min時(shí)，TG誘導(dǎo)的凝膠樣品硬度相比于超聲處理5 min的樣品硬度顯著降低（P＜0.05），這可能是由于超聲促進(jìn)了TG對(duì)蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，但過度交聯(lián)會(huì)形成超長(zhǎng)分子的蛋白質(zhì)，不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)均勻結(jié)構(gòu)的形成[14]。在相同條件下，超聲處理5 min不會(huì)使TG誘導(dǎo)的RBPI凝膠黏附力發(fā)生顯著改變，超聲處理10 min才能使凝膠黏附力顯著升高（P＜0.05），這可能僅僅與樣品表面特性的改變有關(guān)。由此可以推斷，長(zhǎng)時(shí)間超聲處理促進(jìn)了TG的交聯(lián)作用，而交聯(lián)過程中形成的共價(jià)鍵可能是蛋白凝膠黏附力增強(qiáng)的原因[24]。

TG誘導(dǎo)的RBPI凝膠的脫水收縮作用為4.08%，超聲處理顯著降低了TG誘導(dǎo)凝膠的脫水收縮作用（P＜0.05）。與超聲10 min聯(lián)合TG處理的凝膠樣品相比，超聲5 min聯(lián)合TG處理的凝膠樣品具有更低的脫水收縮作用（表1）?？梢酝茢啵琓G的交聯(lián)作用使聚合度增加，從而降低了凝膠結(jié)構(gòu)中的孔隙尺寸，形成更加均勻、一致的結(jié)構(gòu)，此外超聲處理也有助于樣品中孔隙的均勻分布。然而，過長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)導(dǎo)致脫水收縮作用的增加，這可能是樣品中過多聚集體形成導(dǎo)致的，超聲10 min聯(lián)合TG處理的凝膠樣品就是最好證明。脫水收縮作用得到的結(jié)果與SEM結(jié)果一致，證實(shí)了超聲和TG的聯(lián)合作用是一個(gè)重建凝膠結(jié)構(gòu)的可行方法，同時(shí)使凝膠結(jié)構(gòu)更加均勻。Frydenberg等[23]報(bào)道在α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質(zhì)量比較高的溶液中，超聲處理可以有效增加其凝膠持水性，這與本研究中降低脫水收縮作用的效果相同。這種脫水收縮作用下降可能是大量的解折疊和分子間二硫鍵數(shù)量增加從而形成更緊湊的凝膠結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的[25]。

表1 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的RBPI凝膠硬度、黏附力和脫水收縮作用Table 1 Hardness, adhesiveness and syneresis of RBPI gel induced by US-TG treatment

2.4 不同處理對(duì)RBPI表面疏水性和游離巰基含量的影響

表面疏水性用來表征在極性環(huán)境中蛋白質(zhì)表面疏水殘基的數(shù)量，可反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。游離巰基是蛋白質(zhì)中重要的官能團(tuán)，它能參與弱次級(jí)鍵的形成，維持三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其含量能反映蛋白質(zhì)的變性程度。表面疏水性和游離巰基含量均與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)。

如圖4所示，與對(duì)照組相比，超聲處理5 min的RBPI的表面疏水性顯著增加（P＜0.05），由507.43增加至562.75。超聲處理會(huì)破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使蛋白分子發(fā)生部分解折疊和展開，暴露出內(nèi)部的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致表面疏水性增加[26]。然而，TG處理會(huì)使RBPI的表面疏水性顯著降低（P＜0.05），這可能是由于TG催化蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成分子間和分子內(nèi)共價(jià)鍵，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，將疏水基團(tuán)包裹在分子內(nèi)部[17]。此外，Gauche等[27]報(bào)道采用TG處理乳清蛋白后，谷氨酰胺和ε-氨基發(fā)生部分脫酰胺反應(yīng)，產(chǎn)生帶負(fù)電的氨基酸，這也是導(dǎo)致表面疏水性降低的一個(gè)原因。超聲-TG聯(lián)合處理RBPI的表面疏水性進(jìn)一步降低，這表明超聲和TG聯(lián)合處理具有協(xié)同作用，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)而發(fā)生聚集，造成疏水基團(tuán)的內(nèi)卷。

圖4 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理對(duì)RBPI表面疏水性和游離巰基含量的影響Fig. 4 Effect of US-TG treatment on surface hydrophobicity and free sulfhydryl content of RBPI

游離巰基含量與表面疏水性變化趨勢(shì)相似。超聲處理會(huì)顯著增加RBPI的游離巰基含量（P＜0.05），這可能是由于超聲產(chǎn)生的空化和微流束作用使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基基團(tuán)暴露[28]。然而，經(jīng)TG處理后RBPI的游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），Stangierski等[29]采用TG處理肌原纖維蛋白也得到了類似的結(jié)果。TG通過交聯(lián)作用使蛋白質(zhì)形成高分子多聚體，在這個(gè)過程中游離巰基可轉(zhuǎn)化為二硫鍵。經(jīng)過超聲-TG聯(lián)合處理的RBPI具有更低的游離巰基含量，表明RBPI經(jīng)過超聲處理后更利于TG對(duì)蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用。

2.5 不同處理RBPI的FTIR分析結(jié)果

蛋白質(zhì)功能性質(zhì)改善過程中其結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，F(xiàn)TIR圖譜能夠有效提供蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。由圖5可知，與未經(jīng)處理的RBPI相比，超聲處理后RBPI紅外光譜的酰胺I帶處吸收峰沒有明顯變化，而經(jīng)TG處理和超聲-TG聯(lián)合處理后RBPI酰胺I帶處吸收峰強(qiáng)度明顯增加，這可能是由于TG催化蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用，增加了氫鍵的形成[30]。此外，超聲-TG聯(lián)合處理的RBPI酰胺I帶處吸收峰強(qiáng)度高于TG處理的RBPI，說明超聲-TG聯(lián)合處理進(jìn)一步提高了TG的交聯(lián)作用。

對(duì)FTIR光譜中的酰胺I帶進(jìn)行去卷積，然后進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，得到各子峰所對(duì)應(yīng)的歸屬：1 650～1 660 cm-1為α-螺旋，1 618～1 640 cm-1和1670～1690 cm-1為β-折疊，1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲[31]。通過峰面積計(jì)算得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，結(jié)果見表2。超聲處理5 min后RBPI的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量顯著降低（P＜0.05），無規(guī)卷曲含量顯著增加（P＜0.05），β-折疊含量變化不顯著（P＞0.05），這說明超聲處理能夠降低蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性，使二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加無序。Hu Hao等[21]采用功率為200 W的超聲處理大豆蛋白15 min，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，無序結(jié)構(gòu)含量大幅上升，這與本研究結(jié)果一致。與未經(jīng)處理的RBPI相比，TG處理會(huì)導(dǎo)致RBPI的α-螺旋和無規(guī)卷曲含量顯著降低（P＜0.05），β-結(jié)構(gòu)（β-折疊和β-轉(zhuǎn)角）含量顯著增加（P＜0.05）。這可能是由于TG催化的酰基反應(yīng)破壞了使α-螺旋結(jié)構(gòu)規(guī)則排布的氫鍵的穩(wěn)定性，而展開的多肽鏈暴露出更多的氫鍵以及疏水基團(tuán)重新排列，導(dǎo)致在分子聚集過程中重新連接形成β-結(jié)構(gòu)[32]。由此可以推斷，TG處理后使RBPI分子二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加有序，這也與TG催化蛋白質(zhì)交聯(lián)形成聚集體有關(guān)[33]。此外，超聲5 min與TG聯(lián)合處理會(huì)使更多的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，這表明超聲-TG聯(lián)合處理能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)，是修飾蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的有效手段。RBPI功能性質(zhì)的改善可能與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的這種變化有關(guān)。

圖5 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的RBPI FTIR圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

表2 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的RBPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure content of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

2.6 不同處理對(duì)RBPI熱特性的影響

熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化伴隨著熱特性的改變，可通過DSC儀測(cè)定蛋白質(zhì)變性過程中熱量改變以及能量變化而分析蛋白質(zhì)的熱特性[34]。由圖6可知，與未經(jīng)處理的RBPI相比，超聲處理5 min的RBPI反應(yīng)吸收熱降低，而TG處理和超聲5 min聯(lián)合TG處理的RBPI反應(yīng)吸收熱增加且向右偏移，說明蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性發(fā)生改變。

圖6 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的RBPI的DSC圖Fig. 6 Differential scanning calorimetry (DSC) thermograms of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

在DSC結(jié)果中，峰值溫度（Tp）即為蛋白質(zhì)的變性溫度，代表蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性；熱焓變（ΔH）為蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，表征蛋白質(zhì)分子的聚集程度[35]。由表3可知，與未經(jīng)處理的RBPI相比，超聲處理5 min的RBPI的Tp沒有顯著改變（P＞0.05），均在87 ℃左右，而To和Te略有降低。然而，超聲處理顯著降低了RBPI的ΔH（P＜0.05），這可能與蛋白質(zhì)的折疊和聚集狀態(tài)有關(guān)[36]。Dissanayake等[37]研究表明熱焓變與有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量有關(guān)，有序結(jié)構(gòu)的減少可能導(dǎo)致ΔH的降低，這可以由FTIR分析二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果中得到證實(shí)（表2）。TG處理組RBPI的Tp（91.41 ℃）顯著高于未經(jīng)處理RBPI的Tp（87.35 ℃）（P＜0.05），這表明TG催化蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，有利于提高RBPI的熱穩(wěn)定性。TG的交聯(lián)作用使蛋白質(zhì)形成高分子質(zhì)量聚合物，促進(jìn)分子間與分子內(nèi)相互作用，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變的更加的緊湊而有序，因此增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[38]。經(jīng)TG處理后RBPI的ΔH顯著增加（P＜0.05），這可能與TG促進(jìn)無序的蛋白分子內(nèi)、分子間疏水鍵的重新形成以及蛋白質(zhì)交聯(lián)形成聚集體有關(guān)[36]。此外，超聲5 min與TG聯(lián)合處理進(jìn)一步增加了Tp和ΔH，由于超聲引起的空化作用和微流束作用使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的基團(tuán)暴露在分子表面[26]，為TG的交聯(lián)作用提供了更多的作用位點(diǎn)，利于蛋白質(zhì)交聯(lián)形成致密的空間結(jié)構(gòu)，從而改善熱穩(wěn)定性或三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[39]。

表3 超聲-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的RBPI的DSC熱力學(xué)參數(shù)Table 3 DSC thermodynamic parameters of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

3 結(jié) 論

超聲處理能夠使RBPI的乳化活性和發(fā)泡能力顯著增加，但會(huì)降低泡沫穩(wěn)定性。TG能夠使RBPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性提高，破壞樣品的發(fā)泡能力，卻形成了更穩(wěn)定的泡沫。超聲-TG聯(lián)合處理能夠進(jìn)一步提高RBPI的乳化活性和泡沫穩(wěn)定性。超聲處理5 min聯(lián)合TG誘導(dǎo)的RBPI凝膠微觀結(jié)構(gòu)更加均勻、致密，孔隙度更小，且凝膠硬度更大，脫水收縮作用更低，同時(shí)使蛋白質(zhì)表面疏水性和游離巰基含量降低。FTIR和DSC分析表明，超聲-TG聯(lián)合處理能夠使RBPI更多的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行虻摩?折疊結(jié)構(gòu)，且峰值溫度和熱焓變顯著增加，有效改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性，這表明RBPI經(jīng)過超聲處理后更利于TG催化蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，超聲-TG聯(lián)合處理能促進(jìn)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的發(fā)揮。