張 舒，王長(zhǎng)遠(yuǎn),*，盛亞男，馮玉超，富天昕，李 雪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆別名青小豆，在我國種植歷史悠久，是經(jīng)典的藥食同源食品[1]。綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量高于其他常見谷物，且綠豆蛋白富含賴氨酸、亮氨酸和蘇氨酸3 種必需氨基酸[2]，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。綠豆因具有清熱、解毒等功效通常被制作成綠豆湯、綠豆糕、綠豆餅等以供食用，其味道香甜、口感松軟，老少皆宜，熱處理后的綠豆食用范圍更廣泛。有研究表明熱處理后蛋白質(zhì)的變化對(duì)食品的風(fēng)味以及感官特性會(huì)形成有利影響[3]，劉琳琳等[4]發(fā)現(xiàn)微波加熱過程中可能造成蛋白質(zhì)分解，降解成可溶性小分子物質(zhì)，使溶解度增大。Lertittikul等[5]的研究表明熱加工可能會(huì)降低可溶性蛋白分子間作用力，使蛋白喪失凝膠能力，分子質(zhì)量出現(xiàn)不同程度的下降，分子柔順性加大，從而使蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性升髙；Chandrasiri等[6]發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，引起蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)以及功能特性發(fā)生改變。

食品中常用的3 種熱處理方式分別為濕熱、干熱以及微波加熱[7-9]，生活中綠豆的加工多采取濕熱法，最常見的即為蒸制和煮制，研究表明對(duì)綠豆進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒崽幚頃?huì)使其蛋白的溶解性、表面性質(zhì)、持水性、凝膠性以及熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)得到改善[10]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)以蒸制和煮制兩種熱處理后的綠豆為原料提取蛋白，并對(duì)綠豆蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，探討兩種濕熱處理加工方式對(duì)綠豆蛋白功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響，以期找到綠豆的最適加工方式，使其在食品體系中具有良好風(fēng)味及功能性質(zhì)。為綠豆蛋白的改性提供理論依據(jù)，對(duì)促進(jìn)綠豆蛋白在食品行業(yè)中的應(yīng)用以及綠豆產(chǎn)品的精深加工具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆、大豆油為市售；牛血清白蛋白、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、福林-酚試劑，均為國產(chǎn)分析純。1-苯胺基-8-萘磺酸、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、過硫酸銨、甘油、尿素、β-巰基乙醇、乙二胺四乙酸 美國Sigma公司；蛋白Marker（SM0431） 立陶宛Fermentas Life Sciences公司；考馬斯亮藍(lán)G250 天津市科密歐化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀有限責(zé)任公司；DELTA 320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；A360型紫外-可見分光光度計(jì) 翱藝儀器（上海）有限公司；HHS-21-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DGG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Quintik 224-1CN電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Mini-Protean 4電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆的熱加工

將綠豆清洗去除雜質(zhì)，然后置于清水中浸泡10 h，對(duì)浸泡好的完整綠豆進(jìn)行常壓蒸制以及常壓煮制加工，常壓蒸制和煮制均在100 ℃下進(jìn)行，加工時(shí)間均分別為10、15、20、25、30 min。

1.3.2 綠豆蛋白的提取

將加工后的綠豆放入烘干箱烘干至恒質(zhì)量，然后將烘干的各組綠豆粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩，放入燒杯中與石油醚以1∶5（m/V）的比例混合，在攪拌機(jī)的攪拌下脫脂2～3 次，每次5 h，脫脂完成之后將綠豆粉晾干裝入袋中備用。綠豆蛋白的提取采用堿提酸沉法進(jìn)行，參照安家靜等[11]的實(shí)驗(yàn)方法，并略加改動(dòng)：綠豆粉與蒸餾水按1∶10（m/V）的比例混合，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10.0，50 ℃水浴中攪拌提取60 min，以3 500 r/min離心20 min取上清液；用1 mol/L HCl溶液將上清液的pH值調(diào)至等電點(diǎn)，靜置1 h，之后3 500 r/min離心20 min，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 等電點(diǎn)的測(cè)定

根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解性最低的原理，采用福林-酚法[12]在650 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行綠豆蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定。

1.3.4 持水性、持油性的測(cè)定

取0.5 g綠豆蛋白，加入20 mL的蒸餾水混勻，振蕩，靜置20 min后于3 000 r/min下離心30 min，測(cè)定上清液的體積，體積減少的量即為樣品吸附水的量（即樣品吸附水的體積）。

取0.5 g綠豆蛋白，加入10 mL大豆油混勻，振蕩，靜置20 min后于3 000 r/min下離心30 min，測(cè)定上清液體積，體積減少量即為樣品的吸附油的量（即樣品吸附油的體積）[13]。

1.3.5 乳化性、乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

將20 mL質(zhì)量濃度3 g/100 mL的蛋白溶液（pH 7.0）倒入燒杯中，室溫下均質(zhì)30 min，加入40 mL大豆油均質(zhì)2 min，迅速將乳化液倒入100 mL離心管中，2 700 r/min離心5 min，測(cè)量乳化層體積（V1），將上述方法所得混合液80 ℃保溫30 min，冷卻至室溫后2 700 r/min離心5 min，取出測(cè)量乳化層體積（V2）[14]。乳化性和乳化穩(wěn)定性分別按式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.6 起泡性、泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Agyare等[15]的方法，并選擇適當(dāng)條件進(jìn)行測(cè)定：取100 mL質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的蛋白溶液，用自動(dòng)攪拌機(jī)均質(zhì)30 min，快速移至100 mL量筒中，記錄泡沫所占的體積V0，將該量筒放在30 ℃水浴鍋中靜置30 min后，記錄泡沫的殘留體積V1，起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別按式（3）、（4）計(jì)算。

1.3.7 溶解性的測(cè)定

參照賀建華等[12]的實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.204 3x+0.000 2（R2＝0.996 9）。然后測(cè)定不同加工條件下綠豆蛋白的吸光度。0.5 g樣品加入到100 mL的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，攪拌30 min后靜置，3 000 r/min離心20 min[16]，取1 mL上清液加入試管中，然后分別加入1 mL堿性銅溶液和4 mL福林-酚試液，立即搖勻，于55 ℃的水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，取出后置于冷水浴中反應(yīng)10 min，于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式（5）計(jì)算溶解度。

1.3.8 SDS-PAGE測(cè)定

用0.1 mol/L NaOH溶液將綠豆蛋白溶解，蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，然后向其中加入等量的上樣緩沖液，沸水浴5～8 min使蛋白質(zhì)熱變性。蛋白質(zhì)上樣量為10 μL，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）具體步驟：首先用80 V電壓電泳至條帶位于濃縮膠和分離膠分界處，然后加壓至120 V，條帶在分離膠底端處停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)G250對(duì)綠豆蛋白進(jìn)行染色，之后用洗脫液洗脫[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2013軟件進(jìn)行分析和作圖，采用SPSS Statistics 24.0軟件中的獨(dú)立樣品T檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆蛋白的等電點(diǎn)

由圖1可知，當(dāng)pH值為4.5時(shí)吸光度達(dá)到最低，說明此pH值下離心上清液中蛋白質(zhì)的含量最低，則未加工綠豆蛋白的等電點(diǎn)為pH 4.5。對(duì)蒸制和煮制后的綠豆進(jìn)行蛋白提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，熱處理后綠豆蛋白的等電點(diǎn)也會(huì)發(fā)生變化，這與曾劍華等[18]的觀點(diǎn)一致。在堿提酸沉過程中，堿性pH值控制在9.5～10.0的范圍，酸性pH值控制在4.5～4.9范圍時(shí)，可提取出熱處理后的綠豆蛋白。這種情況可能是因?yàn)閷?duì)整個(gè)綠豆體系進(jìn)行熱加工處理后，隨著加工時(shí)間和方式的改變，綠豆蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化[19]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子與大分子物質(zhì)及小分子活性物質(zhì)之間產(chǎn)生相互作用，從而使綠豆蛋白的等電點(diǎn)發(fā)生改變。

圖1 未加工綠豆蛋白等電點(diǎn)Fig. 1 Isoelectric point of raw mung bean protein

2.2 持水性和持油性分析

蛋白質(zhì)的持水性是指蛋白質(zhì)與水直接作用后吸收水分的能力，持油性是指蛋白質(zhì)在一定條件下保持油脂的能力[20]。蛋白的持水性和持油性與食品儲(chǔ)藏過程中的“保鮮”及“成型”有密切關(guān)系。

圖2 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的持水性Fig. 2 Water-holding capacity of steamed or boiled green bean protein

由圖2可見，未經(jīng)加工綠豆蛋白的持水性為3.4 mL/g，處理30 min時(shí)，蒸制綠豆蛋白的持水性增加了23.5%，煮制綠豆蛋白的持水性增加了17.6%。隨加工時(shí)間的延長(zhǎng)，蒸制和煮制處理的綠豆蛋白的持水性均不斷增大，但兩種處理的綠豆蛋白在初始時(shí)持水性差異并不顯著（P＞0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種處理的持水性差異顯著（P＜0.05），在30 min時(shí)兩種處理方式呈極顯著差異（P＜0.01）。由圖2可知，蒸制綠豆蛋白的持水性要高于煮制綠豆蛋白。出現(xiàn)這種情況的原因可能是熱處理使綠豆蛋白的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肽鏈展開，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來，同時(shí)水分子的運(yùn)動(dòng)速率加快，分布更加均勻，促進(jìn)蛋白質(zhì)和水分子發(fā)生相互作用，減少蛋白之間的締合和收縮，呈現(xiàn)較高程度的水化和膨脹[21]。但蒸制過程中水分子的供應(yīng)量較均衡，而煮制過程中水分供應(yīng)充足，過多的水分使得暴露的疏水基團(tuán)主要用來維持蛋白聚集，從而使得疏水基團(tuán)暴露量少于蒸制。故使得長(zhǎng)時(shí)間后兩種處理持水性差異增大。

圖3 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的持油性Fig. 3 Oil-holding capacity of steamed or boiled mung bean protein

由圖3可知，未經(jīng)加工的綠豆蛋白的持油性為4.0 mL/g，處理30 min時(shí)，蒸制綠豆蛋白的持油性增加了32.5%，煮制綠豆蛋白的持油性增加了22.5%。隨加工時(shí)間的延長(zhǎng)，蒸制和煮制處理的綠豆蛋白的持水性均不斷增大，兩種處理的綠豆蛋白的持油性差距較恒定，蒸制綠豆蛋白的持油性要顯著高于煮制綠豆蛋白（P＜0.05）。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)改變或被破壞，肽鏈展開[19]，油在蛋白質(zhì)中的分布更加均勻，增加了蛋白質(zhì)和油分子間的相互作用[22-23]。蒸制與煮制后的綠蛋白相比較，蒸制的持油性要高，這可能是因?yàn)檎糁铺幚砗蟮鞍變?nèi)部的極性基團(tuán)對(duì)油的結(jié)合速率更快，程度更高。周小泉[24]對(duì)菜籽蛋白進(jìn)行干熱加工處理后發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菜籽蛋白的持油性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，可能是因?yàn)榕c豆類蛋白相比菜籽蛋白的成分十分復(fù)雜，蛋白的分子質(zhì)量和顆粒度較大，在較短時(shí)間內(nèi)菜籽蛋白不易于分散到油脂界面[25]。

2.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

乳化性是指蛋白質(zhì)將油和水結(jié)合在一起形成乳狀液的能力，乳化穩(wěn)定性是指油-水乳狀液保持穩(wěn)定的能力[26]。影響乳化性的因素有很多，如蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、蛋白表面疏水性以及空間阻礙等[27]。

圖4 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的乳化性Fig. 4 Emulsifying capacity of steamed or boiled green bean protein

圖5 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的乳化穩(wěn)定性Fig. 5 Emulsion stability of steamed or boiled green bean protein

圖4 、5分別為蒸制和煮制兩種加工方式對(duì)綠豆蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響。綠豆蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性分別為42.3%、50.1%。處理30 min時(shí)，蒸制綠豆蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性分別增加了19.9%、20.8%，煮制綠豆蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性分別增加了18.9%、19.0%。由圖4、5可知，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種處理綠豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均呈上升趨勢(shì)，且蒸制綠豆蛋白乳化性顯著大于煮制綠豆蛋白（P＜0.05），差距較穩(wěn)定；兩種處理的綠豆蛋白在不同時(shí)間下的乳化穩(wěn)定性均差異顯著（P＜0.05），在加工20 min時(shí)蒸制綠豆蛋白的乳化穩(wěn)定性要極顯著高于煮制（P＜0.01）。彭偉偉[28]在熱處理豌豆蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)處理溫度在100 ℃左右，乳化性從11.26 m2/g增加到17.88 m2/g，乳化穩(wěn)定性從14.28 min增加到32.90 min，均顯著增高，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

上述情況的出現(xiàn)可能是因?yàn)闊崽幚磉^程中，綠豆蛋白分子的柔順性提高、疏水性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致乳化性提升。王金梅[29]發(fā)現(xiàn)90 ℃和120 ℃處理后蛋白的乳化性上升，且蛋白表面壓均與時(shí)間呈線性關(guān)系，通過小角X光散射證明蛋白在加熱處理后確實(shí)具有更加柔性的構(gòu)象。熱處理后，綠豆蛋白由于氫鍵的斷裂導(dǎo)致疏水作用的形成以及親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)分布發(fā)生改變[30]，加速了蛋白質(zhì)與小分子生物活性物質(zhì)（如酚類化合物、糖、多肽等）的相互作用，形成了多層蛋白吸附膜，使蛋白質(zhì)降低油-水界面張力的能力增強(qiáng)，繼而使蛋白質(zhì)的乳化性增強(qiáng)[31]。而隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)展開使蛋白分子柔韌性增強(qiáng)，從而可以更快地吸附在表面，從而使熱處理后綠豆蛋白的乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。利用蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性可以將綠豆蛋白應(yīng)用于牛奶、烘焙食品、冷凍食品、湯類食品以及食品添加劑中。

2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析

起泡性是蛋白質(zhì)攪打起泡的能力，泡沫穩(wěn)定性是泡沫保持穩(wěn)定的能力。起泡性是由于蛋白質(zhì)能夠降低氣-液界面的張力來推動(dòng)空氣與液體相結(jié)合所至，并通過吸附在氣-液界面形成保護(hù)膜從而使泡沫穩(wěn)定存在[32]。

圖6 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的起泡性Fig. 6 Foaming capacity of steamed or boiled green bean protein

圖7 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的泡沫穩(wěn)定性Fig. 7 Foam stability of steamed or boiled green bean protein

圖6 、7為蒸制和煮制兩種加工方式對(duì)綠豆蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種處理的綠豆蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且兩種處理之間總體呈顯著性差異（P＜0.05），煮制綠豆蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性均大于蒸制綠豆蛋白。兩種性質(zhì)均在處理25 min時(shí)達(dá)到最佳，且在25 min時(shí)煮制綠豆蛋白的起泡性極顯著高于蒸制綠豆蛋白（P＜0.01），而30 min時(shí)兩種處理的泡沫穩(wěn)定性無顯著性差異（P＞0.05）。綠豆蛋白的起泡性為20.1%，在25 min時(shí)蒸制和煮制綠豆蛋白的起泡性分別為25.0%、25.6%，兩種處理的綠豆蛋白的起泡性分別增加了24.4%、27.4%，該性質(zhì)呈上升趨勢(shì)可能是因?yàn)闊崽幚硪环矫婵赡軙?huì)使綠豆蛋白肽鏈柔軟程度增加，分離的蛋白聚成了小分子亞基[33]，增加了空氣-水界面的蛋白質(zhì)的分子數(shù)量，使蛋白分子在空氣-水界面展開吸附并形成網(wǎng)絡(luò)更加簡(jiǎn)單；另一方面熱處理會(huì)使更多的疏水性氨基酸暴露，疏水相互作用和—SH向—S—S—的交換反應(yīng)增加[34]，從而提高蛋白與空氣結(jié)合的能力，進(jìn)而提高起泡能力。夏寧[35]發(fā)現(xiàn)采用噴射蒸煮處理大米后，大米蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性也顯著提高，與本研究結(jié)果一致。熱處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，兩種性質(zhì)均呈下降的趨勢(shì)，可能是綠豆蛋白肽鏈柔軟程度減弱造成的，故起泡能力隨之減弱。van der Plancken等[36]也認(rèn)為適當(dāng)?shù)臒峒庸ぬ幚砜梢愿纳频鞍踪|(zhì)的起泡能力。

綠豆蛋白泡沫穩(wěn)定性為55.4%，蒸制和煮制的綠豆蛋白泡沫穩(wěn)定性在25 min時(shí)分別為75.7%和77.1%，泡沫穩(wěn)定性分別提高了36.6%、39.2%。整體看來，煮制綠豆蛋白的兩種性質(zhì)均大于蒸制綠豆蛋白，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)同時(shí)含有單體分子和蛋白聚集體，兩種熱處理后大分子蛋白分解成可溶性小分子蛋白，蛋白的溶解度上升，故前期泡沫穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)。后期蛋白質(zhì)溶解度降低，氣泡黏度、厚度、強(qiáng)度變?nèi)?，因此穩(wěn)定性也隨之下降。喬立文[37]發(fā)現(xiàn)熱處理6.5 min前全蛋液的泡沫穩(wěn)定性增加，之后下降，同樣認(rèn)為是蛋白及其復(fù)合物分解使泡沫穩(wěn)定性下降。適宜的起泡性和泡沫穩(wěn)定性可以賦予食品疏松的結(jié)構(gòu)和良好的口感，因此可用于加工奶油、蛋糕、冰激凌等泡沫型的產(chǎn)品。

2.5 溶解性分析

蛋白質(zhì)的溶解性是指蛋白質(zhì)在水溶液或鹽溶液中溶解的能力。通過溶解性可判斷蛋白質(zhì)的變性以及聚集情況，溶解性是蛋白質(zhì)可應(yīng)用性的一個(gè)很重要的指標(biāo)[38]。溶解性好的蛋白質(zhì)易于食品的加工利用，如利用蛋白質(zhì)的溶解性可增加飲料的營養(yǎng)價(jià)值，具有不影響透明度、提高黏度等優(yōu)點(diǎn)。

圖8 蒸制和煮制處理綠豆蛋白的溶解性Fig. 8 Solubility of steamed or boiled green bean protein

由圖8可知，蒸制和煮制兩種加工方式下綠豆蛋白的溶解性均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在20 min時(shí)，溶解性達(dá)到最佳，蒸制綠豆蛋白的溶解度為13.6%，煮制綠豆蛋白的溶解度為13.2%，且蒸制改性的綠豆蛋白溶解度在20 min后要顯著優(yōu)于煮制（P＜0.05）。綠豆蛋白溶解度為9.8%，蒸制綠豆蛋白的溶解度增加了38.8%，煮制綠豆蛋白的溶解度增加了34.7%。在熱處理過程中，初期大分子蛋白質(zhì)降解成可溶性小分子蛋白質(zhì)，使溶解度上升。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，一方面可溶性小分子蛋白聚集成了大分子蛋白質(zhì)；另一方面變性的蛋白質(zhì)可能會(huì)和小分子等活性物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生某種不溶聚集物，從而導(dǎo)致溶解度降低[39]。李爽[40]對(duì)葵花分離蛋白進(jìn)行熱處理改性，發(fā)現(xiàn)熱處理后完全變性的蛋白質(zhì)二硫鍵含量增多，溶解度下降，與本實(shí)驗(yàn)加工20 min后的結(jié)果一致，可能是因?yàn)樵?0 min內(nèi)，蒸制和煮制兩種加工方式均未使綠豆蛋白完全變性，導(dǎo)致溶解度上升。在食品加工過程中，可以適當(dāng)控制熱加工條件，控制大分子聚集物的生成，避免蛋白質(zhì)的溶解性下降。

2.6 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖9 蒸制加工下綠豆蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 9 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of steamed mung bean protein

圖10 煮制加工下綠豆蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 10 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of boiled mung bean protein

圖9 中泳道6、圖10中泳道1均為綠豆蛋白的條帶，均有5 個(gè)亞基條帶，分子質(zhì)量分別為61.7、57.5、50.1、25.1 kDa和19.5 kDa，與曾志紅等[41]研究結(jié)果一致。

相同加工方式下，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白條帶和含量都發(fā)生了變化，大分子質(zhì)量的亞基條帶顏色變淺，小分子質(zhì)量的亞基條帶顏色略加深，即大分子蛋白降解成小分子蛋白；條帶II為8S球蛋白，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸消失。這可能是熱處理使蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈展開斷裂，分解成為小分子蛋白造成的，這與蛋白的功能性質(zhì)相對(duì)應(yīng)；也可能是因?yàn)殡S著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)和小分子等活性物質(zhì)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致亞基條帶變淺。Gambuti等[42]發(fā)現(xiàn)唾液蛋白與單寧結(jié)合互作后，蛋白質(zhì)的亞基條有明顯變淺的趨勢(shì)。兩種處理相比，煮制綠豆蛋白增加了一條分子質(zhì)量為35.4 kDa的條帶VI；而蒸制綠豆蛋白未出現(xiàn)該條帶，只是原有的小分子條帶灰度變淺，含量降低。一方面可能是因?yàn)榇蠓肿拥鞍捉到獬稍摲肿淤|(zhì)量的蛋白；另一方面可能是因?yàn)榇蠓肿拥鞍捉到獬尚》肿拥鞍?，小分子蛋白重新聚集，出現(xiàn)新分子質(zhì)量的蛋白。曾志紅等[41]發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行加工的河南毛綠豆品種蛋白具有6 條亞基條帶，多了一條分子質(zhì)量為39.5 kDa的亞基條帶，與本實(shí)驗(yàn)煮制綠豆蛋白中增加的亞基條帶分子質(zhì)量相似。蒸制綠豆蛋白的功能性質(zhì)普遍比煮制綠豆蛋白的功能性質(zhì)好，也可能是因?yàn)榇蠓肿拥鞍赘嗟胤纸獬闪擞坞x的分子質(zhì)量較小的蛋白。

3 結(jié) 論

本研究通過蒸制和煮制兩種熱處理方式對(duì)綠豆進(jìn)行加工，采用堿提酸沉法提取綠豆蛋白，并對(duì)熱處理后的綠豆蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的測(cè)定，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，蒸制和煮制的綠豆蛋白中大分子蛋白亞基條帶灰度隨熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)均變淺，即其含量均減少；隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，8S球蛋白所在的II亞基條帶逐漸消失；兩種處理相比，煮制綠豆蛋白增加了一條分子質(zhì)量為35.4 kDa的條帶VI；而蒸制綠豆蛋白未出現(xiàn)該條帶。功能性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，兩種處理的綠豆蛋白的功能性質(zhì)均得到改善，優(yōu)于未處理的原綠豆蛋白。與原綠豆蛋白比較，處理結(jié)束時(shí)蒸制和煮制的綠豆蛋白其持水性分別增加了23.5%、17.6%，持油性分別增加了32.5%、22.5%，乳化性分別增加了19.9%、18.9%，乳化穩(wěn)定性分別增加了20.8%、19.0%，起泡性分別增加了24.4%、27.4%，泡沫穩(wěn)定性分別增加了36.6%、39.2%。溶解性分別增加了38.8%、34.7%。蒸制與煮制相比較，除起泡性、泡沫穩(wěn)定性外，蒸制綠豆蛋白的功能性質(zhì)均高于煮制綠豆蛋白。

綜上所述，蒸制和煮制兩種熱處理，會(huì)使綠豆蛋白中大分子蛋白降解成小分子蛋白；煮制處理的綠豆蛋白中還出現(xiàn)分子質(zhì)量為35.4 kDa的蛋白。蒸制和煮制的熱處理方式會(huì)使綠豆蛋白功能性質(zhì)得到改善，使其更有益于食品的加工以及提升綠豆制品的食味品質(zhì)，且蒸制比煮制能更好地提升綠豆蛋白的功能性。研究中還發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)使綠豆蛋白的等電點(diǎn)發(fā)生改變，變化范圍在0.5左右，對(duì)熟制蛋白進(jìn)行提取時(shí)，pH值要適當(dāng)調(diào)整。