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        基于代謝組學(xué)分析不同顏色花生紅衣的組成差異

        2019-10-30 05:32:18高錦鴻朱笑鵬黃紀(jì)念
        食品科學(xué) 2019年19期
        關(guān)鍵詞:黃酮醇紅衣兒茶素

        賈 聰,蘆 鑫,高錦鴻,2,孫 強,2,朱笑鵬,王 強,黃紀(jì)念,4,*

        (1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所,河南 鄭州 450002;2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450002;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點實驗室,湖北 武漢 430062)

        花生是具有很高營養(yǎng)價值的豆科植物[1],種植面積僅次于油菜,居世界油料作物第二位[2]。我國生產(chǎn)的花生45%~50%被用于榨油,其他用以制作花生食品(花生醬、花生飲料、油炸花生仁等)?;ㄉt衣是花生加工生產(chǎn)后的副產(chǎn)物,但其常作為廢棄物直接被丟棄或用作動物飼料,資源未得到充分利用[3]。

        中醫(yī)認(rèn)為花生紅衣味甘、微苦、性平,主治止血、散淤、消腫,具有極大的藥用價值[4]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,花生紅衣中原花青素可以降低小腸吸收膽固醇,緩解動脈粥樣硬化[5-6]。利用花生紅衣萃取液精制而成的注射液應(yīng)用于血友病、血小板減少癥紫癜、肝臟出血、術(shù)后出血后,80%以上病例具有令人滿意的止血效果[7-8]?;ㄉt衣由于其可食用性,還可作為功能因子用于糖和飲料中[9-10]。因此,花生紅衣具有廣闊的應(yīng)用前景。

        然而對花生紅衣的研究起步較晚,已有研究表明花生紅衣中含有豐富的多酚類化合物,如白藜蘆醇、原花青素、黃酮類色素等物質(zhì)[11]。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物,花生紅衣中的含量約為0.65 mg/g[12],具有抗炎、抗過敏、保肝利肝等生理功能[13]。原花青素屬于黃酮醇類化合物,花生紅衣中的原花青素抗氧化活性較強[14],較白藜蘆醇和抗壞血酸具有更強的清除自由基的能力[15]。黃酮類色素是以黃酮為母核而衍生的一類黃色色素,具有抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、延緩衰老等作用[16]。我國的花生種類繁多,不同品種的花生在外觀、組分及性質(zhì)上有明顯差異[17],其花生紅衣的組成也存在差異,目前已有的研究并未系統(tǒng)深入討論花生紅衣代謝層面的差異。代謝組學(xué)主要對生物體內(nèi)代謝小分子和代謝網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)調(diào)控進行全局性分析[18],作為一種新興的研究手段,該技術(shù)已成功應(yīng)用于營養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、疾病診斷等各個領(lǐng)域[19-20]。采用代謝組學(xué)可快速全面分析花生紅衣中多種具有生物活性代謝物的含量變化,有利于科學(xué)評估花生紅衣的應(yīng)用價值,為花生紅衣的質(zhì)量控制及花生種源選育提供參考。

        因此,本實驗選取3 種具有明顯顏色差異的花生紅衣作為研究對象,采用非靶向代謝組學(xué)分析不同花生紅衣品種間的差異代謝物,并對差異代謝通路進行富集,以揭示不同顏色花生紅衣代謝差異性,以期為花生紅衣的加工應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        花生品種(圖1)分別為‘冀花4號’(L*=44.30、a*=20.62、b*=2.46)、‘四粒紅’(L*=31.70、a*=22.48、b*=15.26)、‘國育2016’(L*=20.19、a*=7.93、b*=2.46),由河南綠色作物研究中心提供;花生經(jīng)去紅衣機分離并收集紅衣。

        甲醇、甲酸、水、乙腈(色譜級) 德國CNW公司;L-2-氯苯丙氨酸(分析純) 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

        圖1 花生品種外觀Fig. 1 Photographs of peanut cultivars with varying skin colors

        1.2 儀器與設(shè)備

        JXFSTPRP-24/32全自動樣品快速研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;TYXH-I漩渦振蕩器 上海汗諾儀器有限公司;TGL-16MS臺式高速冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司;SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Acquity UPLC超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) 美國沃特世科技有限公司;Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

        1.3 方法

        1.3.1 花生紅衣的前處理

        稱取80 mg花生紅衣,加入內(nèi)標(biāo)(用甲醇分別配制0.3 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸和0.01 mg/mL十七烷烴)各20 μL和1 mL提取劑(體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液,含0.01 mol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液);在-20 ℃放置2 min預(yù)冷,加入研磨機60 Hz處理2 min;超聲提取30 min(4 ℃);-20 ℃靜置20 min;離心15 min(13 000 r/min、4 ℃),用注射器吸取200 μL上清液,使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后,轉(zhuǎn)移到液相進樣小瓶,-80 ℃下保存,待進行液相色譜-質(zhì)譜分析。所有提取試劑使用前均在-20 ℃進行預(yù)冷。

        1.3.2 液相色譜分析條件

        色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:45 ℃;流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液、流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脫條件為0~2 min:95% A;2~4 min:80% A;4~9 min:75% A;9~17 min:40% A;17~19 min:0% A;19~20 min:95% A;流速:0.4 mL/min;進樣體積:5 μL。

        1.3.3 質(zhì)譜分析條件

        采用電噴霧離子源,樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式,條件如表1所示。

        表1 分析花生紅衣組分的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for component analysis of peanut skins

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        將花生紅衣樣品分為3 組并分別進行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗,第1組為‘冀花4號’,第2組為‘四粒紅’,第3組為‘國育2016’。3 組樣品之間的對比分別記為2/1、3/1、3/2,其中2/1表示‘四粒紅’與‘冀花4號’之間的代謝物比較,3/1和3/2以此類推。

        所有樣品在正負(fù)離子模式下的總離子流圖經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化,得到一個保留時間、質(zhì)荷比(m/z)和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA軟件包,并進行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監(jiān)督的(正交)偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)分析,依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的變量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值>1.0、t檢驗的P<0.05來篩選組間的差異代謝物[21]。代謝物主要依據(jù)其色譜峰保留時間及質(zhì)荷比(m/z),用Progenesis QI代謝處理軟件基于公共數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/和http://www.lipidmaps.org/)及上海鹿明生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫進行定性。利用KEGG(http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html)代謝途徑對差異代謝物的代謝通路進行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同品種花生紅衣的PCA

        通過對所有花生紅衣樣品的基峰色譜圖進行可視化檢查,發(fā)現(xiàn)所有樣品的儀器分析均信號強、峰容量大且保留時間重現(xiàn)性好。‘冀花4號’、‘四粒紅’和‘國育2016’這3 種花生紅衣的正負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖2所示。

        圖2 花生紅衣的負(fù)離子模式(A、B、C)和正離子模式(D、E、F)總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms in negative ion model (A, B and C) and in positive ion model (D, E and F) of peanut skins

        利用SIMCA軟件將圖1的數(shù)據(jù)結(jié)果進行無監(jiān)督的PCA,得到花生紅衣的PCA得分圖(圖3)。從圖3可以看出,3 組花生紅衣的數(shù)據(jù)點在得分圖上可以明顯區(qū)分,‘冀花4號’位于第三象限內(nèi),‘四粒紅’位于第四象限內(nèi),‘國育2016’位于第二象限內(nèi),表明3 組花生紅衣樣品中的代謝物存在明顯差異(代謝物數(shù)量、濃度、種類等)[22-23]。由圖3可知,每組花生紅衣樣品的3 次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)能夠很好地集中在一起,說明在實驗過程中數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好,代謝組組間的分析數(shù)據(jù)可信度較高[23]。

        圖3 花生紅衣的PCA得分圖Fig. 3 PCA score plots for peanut skins with different colors

        2.2 差異代謝物的熱圖分析

        表2 花生紅衣的顯著差異代謝物Table 2 Significantly differential metabolites of peanut red skins with different colors

        采用多維分析和單維分析相結(jié)合的方法,根據(jù)OPLS-DA生成的VIP值來篩選組間差異代謝物(VIP>1)。VIP值越大,說明該差異代謝物對樣品組間的分類判別的影響強度和解釋能力越強[24]。對‘冀花4號’、‘四粒紅’和‘國育2016’分別進行組間分析比較,發(fā)現(xiàn)3 組樣品中均存在的差異代謝物共有218 個。在此基礎(chǔ)上,對組間具有較顯著差異的代謝物進行進一步篩選,最終得到16 種差異代謝物(VIP>5),如表2所示,主要包括黃酮類、黃酮醇類、有機酸類、酯類、肽類、酚類等。已有報道指出花生紅衣含有黃酮類物質(zhì)(毛地黃黃酮、蘆丁、異鼠李黃素配糖體等)[8]、酚酸類物質(zhì)(阿魏酸、綠原酸、對香豆酸等)[25]以及多酚物質(zhì)(原花色素、白藜蘆醇等)[26]等。Lou Hongxiang等[27]分離花生紅衣中的多酚物質(zhì),鑒定其結(jié)構(gòu)為表兒茶素-(2β→O→7,4β→6)-兒茶素和表兒茶素-(4α→8)-沒食子兒茶素-(4α→8)-兒茶素等。而采用代謝組學(xué)分析花生紅衣,鑒定出其中含有的小分子物質(zhì)種類更加豐富、全面,從而為后續(xù)花生紅衣代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供有利的數(shù)據(jù)支撐。

        采用聚類熱圖對16 種差異代謝物在不同花生紅衣品種中的分布情況進行分析。從圖4可以看出,顏色較深的花生紅衣(‘四粒紅’和‘國育2016’)含有的山柰酚和表兒茶素-(4α→8)-沒食子兒茶素-(4α→8)-兒茶素明顯較多,且隨著紅衣顏色的加深,原花青素、楊梅素和槲皮素含量明顯增高。相比于顏色較淺的花生紅衣,顏色較深的花生紅衣中含量較高的差異代謝物主要包括酚類、黃酮類和黃酮醇類化合物,其具有一定的藥理保健作用(如抗氧化、抗炎、防衰老等)[25],有利于調(diào)節(jié)人體免疫機能[24];因此顏色較深的花生紅衣是治療慢性疾病的理想選擇,具有廣闊的開發(fā)前景。對這16 種差異代謝物的相關(guān)性進行聚類分析,根據(jù)相關(guān)系數(shù)可以將其分為3 組(圖4),第1組包括原花青素、楊梅素和槲皮素,第2組包括蘆丁,其余12 種差異代謝物歸為第3組。

        圖4 花生紅衣品種間顯著差異代謝物的熱圖分析Fig. 4 Heat map analysis of differential metabolites in peanut skins from different cultivars

        2.3 差異代謝物的代謝通路分析

        圖5 花生紅衣差異代謝物參與代謝通路富集圖Fig. 5 Enrichment of differential metabolites in metabolic pathways

        圖6 花生紅衣的黃酮和黃酮醇生物合成代謝通路(‘四粒紅’與‘冀花4號’對比分析)Fig. 6 Flavone and flavonol biosynthesis pathways in peanut skins (comparison between ‘Silihong’ and ‘Jihua 4’)

        通過MBRole通路分析功能,利用差異代謝物的KEGG ID進行通路富集分析。由圖5可知,這16 種差異代謝物參與的代謝途徑有10 條,P<0.05表示差異顯著,P值越小,則該代謝通路的差異性越顯著,圖5中P<0.05的代謝途徑有4 條,分別是黃酮和黃酮醇生物合成、類黃酮生物合成、磷脂代謝和線粒體中的脂肪酸伸長,其中黃酮和黃酮醇生物合成途徑最為顯著(P最?。⑴c黃酮和黃酮醇生物合成代謝通路的有4 個差異代謝物,分別是山柰酚、槲皮素、楊梅素和蘆丁。山柰酚是一種多酚類抗氧化物,屬于黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和保肝等功效[28]。槲皮素也是一種黃酮類化合物,具有抗氧化、抗病毒、抗炎等多重生理活性,可用來治療肝、心、脾、肺、腎、骨科等疾病[29]。楊梅素屬于黃酮醇類化合物,具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、保肝和抗氧化等多種藥理活性,尤其在防治心血管疾病方面作用明顯[30-31]。蘆丁屬于黃酮類化合物,具有抗紫外線、抗炎、抗病毒及恢復(fù)毛細(xì)血管正常彈性等多種生理活性,臨床上可用于防治腦溢血、視網(wǎng)膜出血等[32-33]。將‘四粒紅’與‘冀花4號’對比分析,‘四粒紅’的山柰酚在黃酮和黃酮醇生物合成通路中代謝旺盛,而槲皮素、楊梅素和蘆丁合成量較少(圖6);對‘國育2016’與‘冀花4號’對比分析,‘國育2016’的山柰酚和蘆丁在黃酮和黃酮醇生物合成通路中代謝旺盛;將‘國育2016’與‘四粒紅’進行對比分析,‘國育2016’的槲皮素和楊梅素在黃酮和黃酮醇生物合成通路中代謝旺盛。由此可知,顏色較深的花生紅衣(‘四粒紅’和‘國育2016’)中的山柰酚代謝旺盛,顏色較淺的花生紅衣(‘冀花4號’)中楊梅素和槲皮素代謝旺盛,合成量較多。

        3 結(jié) 論

        本實驗利用代謝組學(xué)分析3 種不同顏色花生紅衣中(顏色由淺到深依次是‘冀花4號’、‘四粒紅’和‘國育2016’)的差異代謝產(chǎn)物并富集代謝通路,以期為花生紅衣的綜合利用及種源選擇提供科學(xué)參考。結(jié)果表明不同顏色的花生紅衣存在較大的代謝差異,依據(jù)>OPLS-DA模型的VIP值共篩選出16 種差異代謝物,顏色較深的花生紅衣(‘四粒紅’和‘國育2016’)山柰酚和表兒茶素-(4α→8)-沒食子兒茶素-(4α→8)-兒茶素含量明顯較多,且隨著紅衣顏色的加深,原花青素、楊梅素和槲皮素含量明顯升高。富集差異代謝物的差異顯著代謝通路共4 條,其中最顯著的為黃酮和黃酮醇生物合成途徑,山柰酚、槲皮素、楊梅素和蘆丁4 種差異代謝物參與此通路,山柰酚在顏色較深的花生紅衣中代謝旺盛,而楊梅素和槲皮素則在顏色較淺的花生紅衣中代謝旺盛,合成量較多。

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