宋兵兵，李建科*，2，劉穎沙，劉美慧，吳曉霞

（1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710119；2.陜西師范大學(xué) 食品加工副產(chǎn)物深度開發(fā)與高值化利用校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710119）

肝癌是全球十大常見癌癥之一，是中國(guó)第二大常見惡性腫瘤[1]。原發(fā)性肝癌是臨床上最為常見的惡性腫瘤之一，由于在其發(fā)生早期即可在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即為中晚期，能夠手術(shù)切除者不到20%，近年來全球的肝癌發(fā)病率并未得到有效控制[2]。目前研究表明，腫瘤的生長(zhǎng)和增殖與細(xì)胞的凋亡水平密切相關(guān)[3]。因此，在癌癥防治中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為一個(gè)重要的策略，同時(shí)，在天然產(chǎn)物中尋找具有良好抑癌作用的物質(zhì)，對(duì)于肝癌的防治尤為重要。

茶葉是世界三大飲料之一，我國(guó)是茶葉生產(chǎn)大國(guó)，茶葉在我國(guó)栽培歷史悠久、種植范圍廣，從古至今一直受到人們的青睞。硒是人體必需的微量元素，人體中的硒主要來源于作物，通過富硒食品提高人體中硒含量的研究已成為人體硒營(yíng)養(yǎng)改善的一個(gè)重要領(lǐng)域和熱點(diǎn)[4]。許多研究結(jié)果表明，茶樹有較強(qiáng)富集硒的能力，而茶樹內(nèi)總硒量的高低，主要取決于土壤中的含硒量，紫陽的地質(zhì)構(gòu)造古老而復(fù)雜，早生古代變質(zhì)地層分布廣泛，是我國(guó)少有的富硒巖層[5]。因此，紫陽富硒茶不僅具有普通綠茶的多酚類與咖啡堿等生物活性物質(zhì)，而且富含對(duì)人體重要的硒元素，并且紫陽茶中硒含量豐富是國(guó)內(nèi)首個(gè)通過科學(xué)鑒定和地理標(biāo)志認(rèn)證的天然富硒茶。為此，作者研究了紫陽富硒茶誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的途徑。

作者對(duì)紫陽富硒茶抑癌活性和誘導(dǎo)凋亡途徑做了相關(guān)研究，對(duì)充分發(fā)掘紫陽富硒茶的食用及保健價(jià)值具有積極意義，為紫陽富硒茶的深度加工利用和開發(fā)新型抗腫瘤藥物的研究提供一定的理論參考，同時(shí)，為肝癌的預(yù)防和治療提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞HepG2：購買于第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞庫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）、細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI-1640）、Hoechst33258 染液、RNase酶、熒光PI染液、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）：均購買于美國(guó)Sigma公司；青霉素，硫酸鏈霉素、沒食子酸、硒標(biāo)準(zhǔn)液等其他試劑：均購買于南京建成生物有限公司。

1.2 紫陽富硒茶處理

紫陽富硒茶由中國(guó)陜西省紫陽縣盤龍?zhí)烊桓晃G茶有限公司提供，準(zhǔn)確稱取10 g干燥后的茶葉粉末，放入250 mL錐形瓶中，通過溶劑浸提法得紫陽富硒茶粗提物。最佳浸提富集條件如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度80℃，浸提時(shí)間20 min，料液比1∶25。提取液過濾后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃濃縮，再經(jīng)真空冷凍干燥得到粗提取物在-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液 （含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素）中，在37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期良好的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

設(shè)置3組不同質(zhì)量濃度梯度試驗(yàn)，試驗(yàn)處理組最終濃度分別為 200、400、800 μg/mL 的紫陽富硒茶提取物，陽性對(duì)照組為100 μg/mL的5-Fu，受試物通過無血清培養(yǎng)基溶解，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.2 紫陽富硒茶中硒和茶多酚質(zhì)量濃度的測(cè)定參考“GB 5009.93—2010食品中硒的測(cè)定”和“GB/T 8313—2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法”[6-7]，根據(jù)本試驗(yàn)情況進(jìn)行相關(guān)調(diào)整得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算紫陽富硒茶中硒和茶多酚質(zhì)量濃度。

1.3.3 細(xì)胞增殖和抑制率的測(cè)定采用MTT法測(cè)定紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。通過計(jì)數(shù)制成細(xì)胞密度為（5×103/mL）的細(xì)胞懸浮液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的含紫陽富硒茶的新鮮培養(yǎng)液，并且每一組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定空白和陽性對(duì)照組。將培養(yǎng)板繼續(xù)放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后加入 150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm處對(duì)處理好的樣品進(jìn)行檢測(cè)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)分析通過Hoechst33258染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化[8]。將人肝癌細(xì)胞接種于6孔板中（密度為4×105個(gè)/mL），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入含不同終濃度的紫陽富硒茶培養(yǎng)液，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄掉6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩慢洗兩遍，每孔加4%多聚甲醛1 mL，放置在4℃中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，l5 min后棄固定液，用PBS緩慢洗2次，每孔各加入1 mL質(zhì)量濃度為5 μg/mL的Hoechst33258染液，室溫染色10 min，再用PBS清洗2次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.3.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化運(yùn)用PI染色法，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布[9]，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞接種于50 mL的小培養(yǎng)瓶中（密度為3×105個(gè)/mL），培養(yǎng)24 h后加入不同終濃度的紫陽富硒茶和5-Fu，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別消化、離心、收集細(xì)胞于75%的乙醇溶液中，在-20℃中固定4 h以上，然后離心收集細(xì)胞液，并用PBS清洗2次后，用PBS重懸細(xì)胞，然后加入RNase（1 mg/mL）和 PI（400 μg/mL），常溫避光放置 30 min，最后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組的細(xì)胞周期分布情況。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡通過Annexin V-FITC/PI雙染法，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率[10]。將人肝癌細(xì)胞接種于6孔板中（密度為4×105個(gè)/mL），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入含不同終濃度的紫陽富硒茶培養(yǎng)液和5-Fu，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，用PBS緩慢洗兩遍，消化、離心后收集細(xì)胞，然后用500 μL的結(jié)合液重懸細(xì)胞，再分別加5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI染液，室溫避光放置20 min后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫陽富硒茶中硒質(zhì)量濃度的測(cè)定

在原子熒光分光光度計(jì)最佳儀器工作條件下，測(cè)定質(zhì)量濃度分別為 0、1、2、4、8、10 μg/L 的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。得到回歸方程：y=125.87x+3.356 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，線性回歸良好。

圖1 硒質(zhì)量濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of detecting the selenium content

通過測(cè)定和計(jì)算得：紫陽原茶葉中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.489 mg/kg，浸提富集后茶葉中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.667 mg/kg，根據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《富硒茶》[11]中對(duì)富硒茶含硒量的范圍要求 （0.25～4.00 mg/kg），可知富集后樣品的硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到較高富硒水平。

2.2 紫陽富硒茶中多酚含量的測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制出測(cè)定多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 茶多酚測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of detecting the tea polyphenols

得到回歸方程：y=0.009 2x-0.019 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，線性回歸良好。通過測(cè)定和計(jì)算得：紫陽原茶葉中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.16%，浸提富集后紫陽茶中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.75%。

2.3 紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞存活率的影響

作為MTT的結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其抑制作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度為 200、400、800 μg/mL 的紫陽富硒茶作用24 h后，人肝癌細(xì)胞的存活率分別為81.2%，60.8%、42.5%，而陽性對(duì)照5-Fu的細(xì)胞存活率58.2%。結(jié)果表明，800 μg/mL的紫陽富硒茶的抑制效果顯著高于陽性對(duì)照5-Fu的抑制效果。

圖3 MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Cell viability was determined by the MTT assay

2.4 紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

Hoechst33258染色法測(cè)定細(xì)胞形態(tài)變化的結(jié)果見圖4。從圖4可知，對(duì)照組的細(xì)胞大小均一、輪廓清楚、形態(tài)完整、呈現(xiàn)正常的圓形或者橢圓形態(tài)。與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞生長(zhǎng)均受到明顯抑制，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)和深染色，有的發(fā)生明顯的皺縮，甚至有的細(xì)胞還形成一些絮狀的凋亡小體和細(xì)胞碎片。隨紫陽富硒茶提取物質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，核固縮、核碎裂的現(xiàn)象也更加明顯，癌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài)。

圖4 倒置熒光顯微鏡下觀察不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶處理后人肝癌細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.4 Morphological changes of HepG2 treated with the different concentrations of Ziyang se-rich tea

2.5 紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞周期的影響

紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞周期的影響見圖5。當(dāng)不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶作用于人肝癌細(xì)胞24 h后，伴隨紫陽富硒茶質(zhì)量濃度的增加，人肝癌細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)量增多，而G2期細(xì)胞數(shù)量顯著減少。圖5（a）表明：S期細(xì)胞由18.14%增加至35.27%（p<0.01），同時(shí) G2期細(xì)胞由 11.39% 降低至0.28%。這表明：紫陽富硒茶能阻滯人肝癌細(xì)胞周期停滯在S期，細(xì)胞不能進(jìn)入G2期，DNA合成無法完成，阻止細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，從而抑制細(xì)胞的增殖。

圖5 不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞周期分布的影響Fig.5 Cell-cycle analysis，HepG2 cells were treated with various concentrations of Ziyang se-rich tea

2.6 紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡率的結(jié)果見圖6。當(dāng)不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶作用于人肝癌細(xì)胞24 h后，處理組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，不同質(zhì)量濃度的紫陽富硒茶處理組細(xì)胞凋亡率分別為 34.20%、45.37%、80.25%（P<0.01），具有劑量依賴關(guān)系。并且800 μg/mL處理組的凋亡率接近陽性對(duì)照組5-Fu的凋亡率84.70%。同時(shí)由細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)圖6（b）得知P＜0.01，有極顯著差異，表明紫陽富硒茶能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并呈劑量依賴性。

圖6 不同質(zhì)量濃度紫陽富硒茶對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響Fig.6 Apoptotic rates of HepG2 cells induced by the different concentrations of Ziyang se-rich tea

3 結(jié) 語

目前，化療是治療癌癥的主要措施，它是通過化學(xué)藥物來削弱和破壞癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖[12]。而細(xì)胞凋亡是在某些生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞接受到某種信號(hào)所觸發(fā)的并按一定程序緩慢死亡的過程，借此機(jī)體使不需要的細(xì)胞消亡，維持組織器官細(xì)胞數(shù)目恒定，從而維持生長(zhǎng)平衡的過程[13]。從天然化合物中找尋具有抑癌活性成分的研究成為近年來的熱點(diǎn)，已有研究表明，從一些天然產(chǎn)物中提取的有效成分不僅可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且毒副作用較低[14-15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，茶葉有多方面藥理學(xué)價(jià)值，茶葉多酚具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤和抑制膽固醇上升等功效[16]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，硒有很高的營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值，并且富硒食品的功能性研究也是當(dāng)今熱點(diǎn)，而紫陽富硒茶同時(shí)含有硒和茶多酚等活性物質(zhì)，因此，作者探討了紫陽富硒茶誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡途徑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫陽富硒茶可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，通過阻滯細(xì)胞周期停滯，從而阻礙細(xì)胞內(nèi)DNA合成并誘導(dǎo)凋亡，其可能原因是紫陽富硒茶中主要活性成分硒和茶多酚的協(xié)同作用，但其作用分子機(jī)制和凋亡通路需要進(jìn)一步研究。