袁風(fēng)嬌，王春娟，李雪晴，李劍芳，鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類能夠水解甘露聚糖主鏈中β-1，4-D-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類。大部分β-甘露聚糖酶由催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域組成，碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Carbohydrate-binding module，CBM） 即為一種典型的非催化結(jié)構(gòu)域，一般位于酶的N端或C端[1]。研究證明，CBM可促進(jìn)酶識(shí)別特定底物或底物的某個(gè)區(qū)域，從而提高酶的催化效率并增強(qiáng)底物親和力，同時(shí)在提高酶穩(wěn)定性等方面有著重要作用。如今，融合酶技術(shù)作為一項(xiàng)具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù)已在酶分子改造，提高酶活性、熱穩(wěn)定性、底物特異性等方面取得很大進(jìn)展[2]。構(gòu)建融合酶最簡(jiǎn)單的方式就是通過連接肽將兩個(gè)或多個(gè)蛋白域首尾相連，從而獲得具有不同功能的融合酶。然而，ZHAO等[3]發(fā)現(xiàn)來自Clostridium stercorarium的木聚糖酶中有兩個(gè)不同家族的CBM結(jié)構(gòu)分別位于其N端和C端，當(dāng)除去其N端CBM時(shí)，突變酶的Topt降低10℃，而除去C端CBM時(shí)酶的穩(wěn)定性卻沒有明顯變化，因此認(rèn)為該酶中主要是N端的CBM對(duì)其穩(wěn)定性起作用。JIN等[4]將Pectobacterium chrysanthemi的纖維素酶基因（Cel5Z：：Ω） 和Clostridium thermocellum的木聚糖酶基因（XynX）融合構(gòu)建雙功能酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有將Cel5Z整合到XynX的C末端時(shí)，融合酶才擁有雙功能酶活性。PHAM等[5]將Aspergillus niger Cellobiohydrolase B的CBM融合到Aspergillu terreusβ-甘露聚糖酶的C末端，結(jié)果表明重組Man-CBM的Km值降為0.9 mg/mL，明顯低于Man的Km值（1.3 mg/mL），且前者的熱穩(wěn)定性較后者也有明顯的提高。由此可見，構(gòu)建融合酶時(shí)，CBM融合位置對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)有重要影響。

作者所在實(shí)驗(yàn)室已成功克隆了一株來自Aspergillus usamiiYL-01-785家族的β-甘露聚糖酶基因Auman5A，在對(duì)該基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，此基因編碼的β-甘露聚糖酶AuMan5A是一個(gè)不含CBM的單結(jié)構(gòu)域蛋白[6]。BORASTON等[7]研究證明，來自Thermotoga maritima27家族的CBM可以特異性地結(jié)合甘露聚糖，并對(duì)酶的催化域具有熱保護(hù)作用。本研究將CBM27通過來源于Trichoderma reesei纖維二糖水解酶I的連接肽分別融合至AuMan5A的C末端及N末端，并成功將融合β-甘露聚糖基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A在畢赤酵母GS115中表達(dá)，分析CBM27融合前后以及不同融合位置對(duì)AuMan5A酶學(xué)性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基 表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K、E coliJM109、DH5α 和Pichia pastorisGS115 由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆質(zhì)粒pUCm-T，購自上海Sangon公司；重組質(zhì)粒pUCm-T-Auman5A、pUCm-T-cbm27和pPIC9K-Auman5A，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏；LB、MD、YPD、YPD-G418、BMGY 和 BMMY 培養(yǎng)基的配制參照Multi-CopyPichiaExpression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.1.2 主要試劑 rTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，均購自大連TaKaRa公司；EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒、Geneticin G418、250 bp ladder marker和protein Marker，購自上海Sangon公司；角豆膠、D-甘露糖，Sigma公司產(chǎn)品；DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75，Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Auman5A序列（GenBank：HQ839639）及連接肽（GenBank：GL985084） 與CBM27編碼基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A所需的8條PCR引物（表1），委托上海Sangon公司合成。

表1 擴(kuò)增融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A的PCR引物Table1 PCR Primers for the amplification of fusion enzyme genes Auman5A-cbm27 and cbm27-Auman5A

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以pUCm-TAuman5A為模板，AC-F1、AC-R1為引物PCR獲得基因片段A1；以pUCm-T-cbm27為模板，TC-F1、TC-R1為引物PCR獲得基因片段C1；然后以A1和C1互為引物和模板第2輪重疊PCR初步合成Auman5A-cbm27基因，再加入引物AC-F1和TCR1，進(jìn)行第3輪PCR擴(kuò)增Auman5A-cbm27基因。同理，利用3輪重疊PCR，擴(kuò)增合成cbm27-Auman5A基因。將純化的目的PCR產(chǎn)物與克隆質(zhì)粒pUCm-T連接獲重組質(zhì)粒pUCm-T-Auman5A-cbm27和pUCm-T-cbm27-Auman5A，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，藍(lán)白斑篩選和DNA測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收目的基因，與經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Auman5A-cbm27和pPIC9K-cbm27-Auman5A，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 β-甘露聚糖酶的表達(dá)和純化 分別將pPIC9K-Auman5A、pPIC9K-Auman5A-cbm27和pPIC9K-cbm27-Auman5A用SalⅠ線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照基因脈沖儀（Bio-Rad公司）說明書。重組畢赤酵母的鑒定、多拷貝篩選和誘導(dǎo)表達(dá)等參照Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊(cè)。整合有空pPIC9K質(zhì)粒的畢赤酵母GS115做空白對(duì)照。β-甘露聚糖酶的具體純化方法參照文獻(xiàn)[8]。SDS-PAGE分析重組表達(dá)產(chǎn)物，Bradford法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 β-甘露聚糖酶活性的測(cè)定 在20 mL具塞試管中加入2.4 mL 5 mg/mL角豆膠溶液（用pH 3.6、50 mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制），50 ℃保溫5 min；再加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)15 min；加入2.5 mL DNS試劑，在沸水浴顯色7 min，測(cè)定OD540值。在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以D-甘露糖計(jì)）所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.5 β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1）溫度對(duì)酶活性的影響：在不同溫度（50～80℃）下，按1.2.4方法測(cè)定酶活性。最適溫度Topt定義為最高酶活性（以相對(duì)酶活性100%計(jì)）所對(duì)應(yīng)的溫度。將酶液用緩沖液適當(dāng)稀釋后，分別置于45、50、55、60、65、70 ℃和 75 ℃下，保溫 1 h，測(cè)定不同溫度下樣品酶的活性。酶的熱穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上所對(duì)應(yīng)的溫度范圍。

采用蛋白熱移位（PTS）法測(cè)定 AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的熔解溫度（melting temperature，Tm）。具體方法參見文獻(xiàn)[10]，并略作修改。按照PTS Kit操作手冊(cè)將蛋白質(zhì)樣品和熒光染料混合，利用羅氏LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)定量PCR系統(tǒng)，在50～95℃溫度范圍內(nèi)，以1℃/min的升溫速率，在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為533 nm和640 nm下檢測(cè)熒光信號(hào)，繪制熔解曲線；利用“Tm calling”分析方法獲得衍生熔解曲線，其峰值對(duì)應(yīng)的溫度即為Tm值。

2）pH對(duì)酶活性的影響：用pH 2.5～6的緩沖液配制0.5%（質(zhì)量體積比）角豆膠溶液，按1.2.4方法測(cè)定酶活性。最適pH定義為最高酶活性所對(duì)應(yīng)的pH 值。將酶液在 pH 2～10.5、40℃處理 60 min，按1.2.4方法測(cè)定殘余酶活性。酶的pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上所對(duì)應(yīng)的pH范圍。

3）β-甘露聚糖酶催化效率的測(cè)定：分別用pH 3.6、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制不同濃度（1.0～10 mg/mL）的角豆膠溶液，在酶各自的最適溫度下按1.2.4方法測(cè)定其酶活性。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)kcat和Km及催化效率kcat/Km值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以pUCm-T-Auman5A為模板，經(jīng)過第1輪PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為1100 bp的基因片段A1（圖1泳道1）；以pUCm-T-cbm27為模板，經(jīng)第2輪PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為550 bp的基因片段C1（圖1泳道2）；經(jīng)過第3輪PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為1600 bp的Auman5A-cbm27（圖1泳道3）。同上，采用3輪PCR擴(kuò)增分別獲得長(zhǎng)度約為550 bp的 C2、1100 bp的 A2和 1600 bp的cbm27-Auman5A（圖1泳道4、5和6）?；驕y(cè)序結(jié)果顯示融合基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A長(zhǎng)度均為1610 bp（含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)），與預(yù)期一致。將它們分別克隆至pPIC9K，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。經(jīng)上海Sangon公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果都包含1638 bp的目的基因和pPIC9K質(zhì)粒上醇氧化酶基因AOX1約500 bp的序列，表明2種重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Auman5A-cbm27和pPIC9K-cbm27-Auman5A構(gòu)建成功。

圖1 融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of two fusion mannanase gene，Auman5A-cbm27 and cbm27-Auman5A

2.2 重組β-甘露聚糖酶的表達(dá)和純化

挑選在YPD-G418（4.0 mg/mL）平板上長(zhǎng)勢(shì)良好，分別整合有Auman5A、Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A的畢赤酵母單菌落轉(zhuǎn)化子，按Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊(cè)進(jìn)行常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)，分別篩選得到3個(gè)產(chǎn)酶活性最高的重組子 GS115/Auman5A、GS115/Auman5A-cbm27和GS115/cbm27-Auman5A（圖 2泳道 1～3）， 按 1.2.4方法測(cè)定粗酶液的酶活性分別為33.8、43.2、21.7 U/mL，而在空白對(duì)照GS115/pPIC9K上清液中未檢測(cè)到β-甘露聚糖酶活性。

圖2 表達(dá)上清液和純化酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE Analysis of the expressed supernatants and purified mannanases

分別通過（NH4）2SO4沉淀、陰離子交換層析、超濾及凝膠過濾層析將篩選得到的3個(gè)菌株誘導(dǎo)得到的培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。純化后的reAuMan5A、reAuMan5A-CBM27和CBM27-reAuMan5A分別在約 49.8×103、60.2×103、60.2×103（表觀分子量） 顯示出單一條帶（圖2泳道4～6）。按1.2.3方法測(cè)得純化后的3個(gè)酶的比酶活分別為230.6、280.3、281.1 U/mg。

2.3 重組β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析與討論

2.3.1 溫度對(duì)甘露聚糖酶活性的影響 按1.2.5方法分別測(cè)定了溫度對(duì)AuMan5A、AuMan5A-CBM27、CBM27-AuMan5A 活性的影響（圖3）。由圖3（a）可見，AuMan5A、AuMan5A-CBM27 的Topt均為 70℃，而CBM27-AuMan5A的Topt較AuMan5A降低了約10℃。由圖 3（b）可見，AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A分別在68℃和58℃及以下保持穩(wěn)定，較AuMan5A分別提高了8℃和降低了2℃。結(jié)果表明：當(dāng)CBM27融合在AuMan5A的C末端時(shí)才對(duì)酶的催化中心發(fā)揮出熱保護(hù)作用。然而，XU等[11]將來自Thermotoga marimitaGH10家族耐熱的木聚糖酶C端的CBM2融合至來自Aspergillus nigerGH11家族木聚糖酶的N端時(shí)發(fā)現(xiàn)，融合酶的Topt提高了2℃，催化效率提高了4.5倍。因此，有研究者認(rèn)為CBM及其融合位置對(duì)于酶穩(wěn)定性的影響還存在爭(zhēng)議，酶的熱穩(wěn)定性除了與CBM有關(guān)外，還與其本身的氨基酸序列有關(guān)，當(dāng)CBM位于酶特定的位置時(shí)，會(huì)與其本身的氨基酸形成氫鍵等相互關(guān)系，從而使酶的穩(wěn)定性提高。因此，CBM對(duì)酶分子穩(wěn)定性提高的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

圖3 溫度對(duì)3種重組β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.3 Effects of temperature on the activities of three recombinant β-mannanases

熔解溫度Tm表示在溫度上升過程中蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊到一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度，Tm值越高，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性越高，因此Tm值是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)耐熱性的重要參數(shù)[12]。由圖4可知，AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的Tm值分別為66.5、74.2、61.3℃，與酶的熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)基本保持一致。

圖 4 AuMan5A、AuMan5A-CBM27 和 CBM27-AuMan5A的熱變性曲線Fig.4 Thermaldenaturation curvesofAuMan5A、AuMan5A-CBM27 and CBM27-AuMan5A

2.3.2 pH對(duì)甘露聚糖酶活性的影響 按1.2.5方法分別測(cè)定了pH對(duì)AuMan5A、AuMan5A-CBM27、CBM27-AuMan5A 活性的影響（圖5）。由圖5（a）可見，野生型酶和融合酶的最適pH均為4.0，AuMan5A在pH值2.5～7.5范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（圖5（b））。而 AuMan5A-CBM27、CBM27-AuMan5A 均在pH 2.0～9.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。由此可見，將CBM27融合至C或N末端均拓寬了AuMan5A的反應(yīng)pH值范圍。

2.3.3 酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)分析 按1.2.5方法測(cè)定了3種β-甘露聚糖酶水解角豆膠的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和kcat（表 2）。分析結(jié)果表明 AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的催化效率（kcat/Km）較AuMan5A均有不同程度的提高，但AuMan5A-CBM27的催化效率最高。因此，不論CBM27融合至AuMan5A的C末端或N末端都可以提高β-甘露聚糖酶的催化效率，當(dāng)位于C末端時(shí)催化效率的提高幅度更大。研究證明，CBM27可以特異性地結(jié)合甘露聚糖，并對(duì)酶的催化結(jié)構(gòu)域起熱保護(hù)作用，且大部分CBM都具有結(jié)合纖維晶體的表面，并通過與帶電氨基酸間形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，以及催化結(jié)構(gòu)域堆積作用與不溶性底物結(jié)合，從而增強(qiáng)底物親和力和催化效率[6]。

圖 5 pH對(duì)3種β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of pH on the activities of three β-mannanases

表2 3種β-甘露聚糖對(duì)底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table2 Kinetic parameters of three β-mannanases

3 結(jié)語

基于融合蛋白設(shè)計(jì)的融合酶技術(shù)是分子酶工程的一個(gè)研究熱點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于多功能酶的構(gòu)建與應(yīng)用[13]，并顯示出重要的理論和應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了融合β-甘露聚糖酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。通過研究發(fā)現(xiàn)融合酶與親本酶在酶學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)常數(shù)等方面的差別表明，CBM27融合位置的變化，對(duì)融合酶的酶學(xué)性質(zhì)有顯著的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，重組融合酶reAuMan5ACBM27具有熱穩(wěn)定性高、pH穩(wěn)定范圍廣、底物親和力強(qiáng)和催化效率高等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)化生產(chǎn)中有著巨大的應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)對(duì)CBM融合位置對(duì)酶功能的影響的研究為其他融合酶基因的開發(fā)和應(yīng)用提供了新的思路和策略。