牛婉秋 康 瑜 唐 玲 于布為 薛慶生

經(jīng)歷極度創(chuàng)傷事件后可導(dǎo)致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)，PTSD的患病率為5%～10%，在高度暴露的創(chuàng)傷人群中可達(dá)20%～30%[1]。臨床麻醉也會遭遇與麻醉和手術(shù)相關(guān)的PTSD，術(shù)中意外知曉是醫(yī)源性PTSD發(fā)生的重要因素。臨床常用的吸入麻醉藥物對于PTSD的影響仍不清楚，PTSD相關(guān)記憶改變的發(fā)病機制也尚未闡明。PTSD被認(rèn)為是一種記憶障礙，其中與創(chuàng)傷事件相關(guān)的線索形成強大的感覺記憶[2]，因此，情景是恐懼條件反射和恐懼消退的關(guān)鍵因素。研究[3]發(fā)現(xiàn)，海馬體在情景恐懼記憶中發(fā)揮關(guān)鍵作用。突觸后致密蛋白95(PSD95)在突觸可塑性和學(xué)習(xí)與記憶中具有重要作用。研究[4]證明，PSD95可以調(diào)節(jié)突觸發(fā)育，并在突觸穩(wěn)定和可塑性中發(fā)揮重要作用。本研究通過情景條件恐懼實驗建立PTSD恐懼記憶的小鼠模型，觀察七氟烷對恐懼記憶消退的影響效應(yīng)，并探討海馬PSD95的表達(dá)在該效應(yīng)中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。選用36只C57BL/6品系雄性小鼠，7～8周齡，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為SYXK(滬)2008-0050。兔抗小鼠PSD95抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗小鼠β-actin抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 分組 將小鼠隨機分入電刺激+七氟烷組、電刺激對照組和空白對照組，每組12只。

1.3 行為學(xué)實驗

1.3.1 情景條件恐懼實驗 實驗方案參考之前PTSD的相關(guān)研究[5-6]。應(yīng)用條件恐懼實驗裝置(型號為46453，意大利Ugo Basile公司)。將小鼠放入電擊箱中適應(yīng)3 min，隨后播放聲音作為條件性刺激(CS，90 dB，1 kHz)， 維持60 s， 聲音結(jié)束前0.5 s對小鼠進行足底電擊作為非條件性刺激(US，0.8 mA，0.5 s)，電擊后繼續(xù)停留60 s使CS和US的記憶相偶聯(lián)，在間隔 1 min后重復(fù)進行記憶偶聯(lián)訓(xùn)練，共進行5次。在訓(xùn)練結(jié)束20 min后，電刺激+七氟烷組小鼠給予含體積分?jǐn)?shù)為0.03的七氟烷氣體(氧氣體積分?jǐn)?shù)為0.3的混合氣體)吸入4 h，電刺激對照組小鼠給予不含七氟烷的相同混合氣體吸入4 h。由于吸入的七氟烷為麻醉劑量，將小鼠放置在加溫毯上保持其正常體溫?？瞻讓φ战M完成同樣的訓(xùn)練流程，但不給予CS和US。

1.3.2 恐懼記憶測試 在情景條件恐懼實驗結(jié)束后第1、2、4和6周進行恐懼記憶測試，測試小鼠的恐懼記憶功能。首先進行情景測試，將小鼠置于箱體內(nèi)，適應(yīng)3 min后，記錄接下來3 min的僵直時間，繼續(xù)停留1 min后將小鼠取出。情景測試結(jié)束后2 h進行聲音測試，將小鼠放入箱體3 min后，播放聲音，記錄聲音刺激時小鼠的僵直時間，聲音停止1 min后將小鼠放回鼠籠。

1.4 檢測PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量 在第6周恐懼記憶測試后，留取3組小鼠的海馬組織，采用Western印跡法檢測蛋白質(zhì)含量。用于蛋白質(zhì)印跡分析的抗體是PSD95(1∶500，Cell Signaling Technology，#3409)和β-actin(1∶5 000，Sigma-Aldrich，A1978)。應(yīng)用ImageQuant LAS 4000成像系統(tǒng)顯影，NIH Image J軟件分析條帶的吸光度值，計算小鼠海馬區(qū)PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)實驗結(jié)果 在情景條件恐懼實驗結(jié)束后第1周的情景測試和聲音測試中，電刺激對照組和電刺激+七氟烷組小鼠的僵直時間均顯著長于空白對照組(P值均<0.05)，電刺激對照組與電刺激+七氟烷組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。在情景條件恐懼實驗結(jié)束后第2、4和6周的情景測試和聲音測試中，電刺激對照組和電刺激+七氟烷組的僵直時間均顯著長于空白對照組(P值均<0.05)，電刺激+七氟烷組的僵直時間又均顯著長于電刺激對照組(P值均<0.05)。見表1。

組別時間情景測試聲音測試空白對照第1周5.17±0.6510.30±2.19第2周5.30±0.938.37±1.54第4周4.92±0.818.98±1.00第6周4.20±0.629.03±1.62電刺激+七氟烷第1周66.81±8.71①115.00±6.29①第2周52.93±6.00①92.68±12.40①第4周60.28±6.88①105.90±9.03①第6周27.77±3.05①66.43±7.01①電刺激對照第1周53.26±11.93①97.15±7.06①第2周37.92±4.24①②60.92±9.69①②第4周42.30±5.37①②70.85±10.63①②第6周19.11±2.55①②43.38±8.18①②

與空白對照組同時間比較：①P<0.05。與電刺激+七氟烷組同時間比較：②P<0.05

2.2 PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量 空白對照組、電刺激+七氟烷組和電刺激對照組的PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量分別為0.77±0.02、0.35±0.03、0.61±0.04，電刺激對照組和電刺激+七氟烷組均顯著低于空白對照組(P值均<0.05)，電刺激+七氟烷組又顯著低于電刺激對照組(P<0.05)。見圖1。

1～3 空白對照組 4～6 電刺激+七氟烷組 7～9 電刺激對照組圖1 3組小鼠PSD95蛋白質(zhì)表達(dá)電泳圖

3 討 論

本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠通過基底外側(cè)杏仁核去甲腎上腺素能系統(tǒng)[7]和海馬區(qū)調(diào)控突觸可塑性的γ-氨基丁酸A型受體(GABAA 受體)α5亞單位[8]促進實驗動物恐懼記憶的消退，但是對于七氟烷對實驗動物恐懼記憶的影響尚不清楚。本研究通過建立小鼠PTSD模型，發(fā)現(xiàn)在PTSD傷害性刺激發(fā)生后的記憶鞏固期吸入七氟烷麻醉4 h，能夠抑制PTSD模型小鼠的恐懼記憶消退過程，同時也會抑制PTSD模型小鼠海馬區(qū)域PSD95的表達(dá)。

關(guān)于PTSD的建立模型有很多，其中，情景條件恐懼實驗是經(jīng)典的動物模型[9]。PTSD患者的海馬區(qū)神經(jīng)功能受到抑制，同時伴隨神經(jīng)元突觸可塑性的下調(diào)是其病理生理的主要機制。突觸可塑性主要包括長時程增強(LTP)和長時程抑制(LTD)。突觸傳遞的LTP是研究最多的哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中學(xué)習(xí)和記憶過程的神經(jīng)生理學(xué)模型，并且是應(yīng)激和記憶相互作用的敏感指標(biāo)。最近有研究[10]結(jié)果表明，行為靈活性與LTD之間存在聯(lián)系。PSD95作為突觸后致密蛋白體，是突觸后成分和突觸可塑性[11-12]的標(biāo)志物。相關(guān)研究[13-14]結(jié)果顯示，PSD95的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)破壞。本研究結(jié)果顯示，七氟烷抑制了PTSD小鼠恐懼記憶的消退，并且使PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量下降，因此七氟烷可能是通過降低PSD95的表達(dá)，從而導(dǎo)致突觸可塑性的下調(diào)，進而影響恐懼記憶的消退。

本研究為臨床實踐中經(jīng)歷創(chuàng)傷等不良應(yīng)激事件的個體更加科學(xué)地選擇麻醉藥物，以減少創(chuàng)傷性記憶對其精神心理的影響提供了相應(yīng)的實驗依據(jù)。本研究仍然存在以下不足：①學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)相對廣泛，本研究僅選擇檢測海馬組織的PSD95，觀察范圍缺乏全面性和完整性；②沒有在造模之前檢測3組小鼠的PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量；③僅發(fā)現(xiàn)了PSD95蛋白質(zhì)相對表達(dá)量與恐懼記憶的相關(guān)性，并沒有進一步用電生理的指標(biāo)來檢測突觸可塑性。

綜上所述，七氟烷可以加重PTSD小鼠的恐懼癥狀，抑制恐懼記憶的消退。這一作用可能是通過七氟烷抑制海馬區(qū)PSD95的表達(dá)來實現(xiàn)的。