李嘉楠， 馮明陶， 李 強(qiáng)， 許 奕， 張 琪， 劉建民

海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200433

靜脈高壓已為誘發(fā)硬腦膜動(dòng)靜脈瘺(dural arteriovenous fistula, DAVF)發(fā)生發(fā)展的主要原因，但靜脈高壓通過何種發(fā)病機(jī)制發(fā)揮作用仍不確定。目前的研究[1-2]認(rèn)為，靜脈端壓力升高造成低灌注和靜脈剪應(yīng)力的改變，進(jìn)而使血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)上調(diào)，是促使硬膜血管新生的重要機(jī)制。血管內(nèi)皮細(xì)胞可將剪應(yīng)力等機(jī)械性刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，但其機(jī)制尚不明確。

膽固醇代謝在維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而關(guān)于其調(diào)控血管新生的機(jī)制仍不明確。Kwon等[3]在1998年在高膽固醇豬模型中發(fā)現(xiàn)，膽固醇增加可使動(dòng)脈血管滋養(yǎng)血管網(wǎng)密度增加，提示膽固醇代謝紊亂可能與血管新生相關(guān)。但是，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，膽固醇代謝紊亂通過何種機(jī)制啟動(dòng)血管新生目前暫不明確。

載脂蛋白A-1結(jié)合蛋白(apoA-I binding protein，AIBP)是最早由Ritter等通過酵母雙雜交技術(shù)從人肝臟cDNA文庫中篩選出來的分泌蛋白，其編碼基因?yàn)锳POA1BP，位于1號(hào)染色體長臂21區(qū)[4-5]。Fang等[6]發(fā)現(xiàn)，AIBP在膽固醇代謝調(diào)控血管新生的過程中起關(guān)鍵作用。AIBP協(xié)同高密度脂蛋白調(diào)控膽固醇流出，進(jìn)而通過改變細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu)，抑制VEGF受體與脂筏中的小窩蛋白共定位，阻斷VEGF信號(hào)通路，起到抑制血管新生的作用。因此，本研究通過大鼠靜脈高壓模型及體外實(shí)驗(yàn)探討AIBP在剪應(yīng)力導(dǎo)致的血管新生中發(fā)揮的作用及其機(jī)制，以期為DAVF的臨床治療提供參考標(biāo)靶。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及模型的建立 清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～220 g ，購自海軍醫(yī)學(xué)研究所，將SD大鼠置于小動(dòng)物麻醉誘導(dǎo)箱，行5%異氟烷麻醉誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后，行2%異氟烷面罩吸入維持麻醉狀態(tài)。將大鼠隨機(jī)均分為4組(每組20只)：A組大鼠行右側(cè)頸動(dòng)脈-頸外靜脈吻合術(shù)+左側(cè)橫竇閉塞術(shù)+頂骨磨除術(shù)；B組大鼠行右側(cè)頸動(dòng)脈-頸外靜脈吻合術(shù)+頂骨磨除術(shù)；C組大鼠行右側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)+右側(cè)頸外靜脈結(jié)扎術(shù)+頂骨磨除術(shù)；D組大鼠行頂骨磨除術(shù)。

1.2 細(xì)胞及試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)株購自中國科學(xué)院上海分院。胰蛋白酶、青霉素G鈉鹽、硫酸鏈霉素購自美國AMRESCO公司；高糖DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；OBS鹽酸緩沖溶液購自上海索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自深圳市賽亞生物技術(shù)有限公司。VEGF、AIBP單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司；VEGF、AIBP酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購自武漢Elabscience公司；總膽固醇測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 HUVEC爬片制備及培養(yǎng) 將3片載玻片(2.5 cm×7.5 cm×1 mm)置于10 cm×10 cm培養(yǎng)皿中，用水浴融化的1%明膠溶液包備備用。HUVEC置于37℃、5%CO2條件傳代培養(yǎng)，消化后將細(xì)胞懸液移至50 mL離心管中，將細(xì)胞密度調(diào)至8×106后，充分吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液后，接種于鋪好載玻片的方形培養(yǎng)皿中，繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng)24～48 h。將細(xì)胞恒切應(yīng)力流動(dòng)態(tài)培養(yǎng)儀置于超凈臺(tái)并連接好；加30 mL配制好的高糖DMEM培養(yǎng)液于蓄液瓶中，將其置于37℃、5%CO2孵箱。將孵箱外管道連接到恒剪應(yīng)力驅(qū)動(dòng)原上，排除管道內(nèi)剩余氣體。在超凈臺(tái)內(nèi)將準(zhǔn)備好的細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)腔中，培養(yǎng)腔移入孵箱內(nèi)，連接于平波器與蓄液瓶之間。將剪應(yīng)力驅(qū)動(dòng)原連接至計(jì)算機(jī)，啟動(dòng)程序。恒剪應(yīng)力下培養(yǎng)HUVEC 24 h。

1.4 上矢狀竇剪應(yīng)力測(cè)定 SD大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)3個(gè)月后，經(jīng)5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，取俯臥位。用彩色多普勒超聲探測(cè)儀(探頭頻率11.1 MHz)，于大鼠頭頂部探測(cè)上矢狀竇，待波形穩(wěn)定后，測(cè)量上矢狀竇管徑及血流速度。剪應(yīng)力(τ)=4μQ/πr3，其中Q=1/4πd2v×60。其中Q為血流量，r為血管半徑，d為血管內(nèi)徑，v為血流速度，μ為血液黏度系數(shù)。

1.5 Western印跡法測(cè)定硬膜組織AIBP、VEBF蛋白表達(dá) 取硬膜組織勻漿，離心，取上清，進(jìn)行蛋白定量和免疫印跡檢查。各樣品總蛋白(40 μg)電泳，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，一抗(AIBP 1∶800；VEGF 1∶2 000) 4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶50 000)37℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，顯影。用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA 取硬膜組織勻漿，加入TRIzol試劑，冰上提取RNA。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。AIBP引物序列：正向?yàn)?′- AGA CTT GCT CAT ATC CCT CAC A-3′，反向?yàn)?′-CAG ACG ATA GAC ACA CTC GGT-3′。VEGF引物序列：正向?yàn)?′-CTT GCC TTG CTG CTC TAC CT-3′，反向?yàn)?′-GCA GTA GCT GCG CTG ATA GA-3′。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.7 免疫組化 制備硬腦膜組織石蠟切片，脫蠟，蘇木精染色，光鏡下觀察硬膜及附近血管病理變化。采用Image-Pro Plus軟件處理染色后的免疫組化切片，計(jì)算平均光密度值。校正光密度后，設(shè)置測(cè)量參數(shù)，選擇測(cè)量區(qū)域，設(shè)置色彩，測(cè)量該區(qū)域的面積；平均光密度=累計(jì)光密度/區(qū)域面積。

1.8 細(xì)胞中AIBP、VEGF及總膽固醇含量測(cè)定 將制備好的細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min后取細(xì)胞上清液，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)HUVEC中AIBP及VEGF含量。將制備好的細(xì)胞懸液以1000 r/min離心10 min，留取細(xì)胞沉淀，按照總膽固醇測(cè)定試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用方差分析，組間比較采用LSD-t及Dunnett-t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠上矢狀竇血流動(dòng)力學(xué)的比較 大鼠飼養(yǎng)3個(gè)月后，取建模成功者48只測(cè)量并計(jì)算上矢狀竇剪應(yīng)力。結(jié)果(表1)顯示：與D組相比，A、B組上矢狀竇內(nèi)流速明顯加快，剪應(yīng)力明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組上矢狀竇內(nèi)流速及剪應(yīng)力改變不明顯。結(jié)果(圖1)表明：剪應(yīng)力與流速正相關(guān)。

表1 各組大鼠上矢狀竇血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

A組：右側(cè)頸動(dòng)脈-頸外靜脈吻合術(shù)+左側(cè)橫竇閉塞術(shù)+頂骨磨除術(shù)；B組：右側(cè)頸動(dòng)脈-頸外靜脈吻合術(shù)+頂骨磨除術(shù)；C組：右側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)+右側(cè)頸外靜脈結(jié)扎術(shù)+頂骨磨除術(shù)；D組：頂骨磨除術(shù).*P<0.05與D組相比較

圖1 上矢狀竇流速與剪應(yīng)力的關(guān)系

2.2 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF蛋白的表達(dá) Western印跡結(jié)果(圖2)顯示：術(shù)后3個(gè)月，A組、B組硬膜組織中AIBP表達(dá)明顯低于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組、B組硬膜組織中VEGF表達(dá)明顯高于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF mRNA的表達(dá) real-time PCR檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示：術(shù)后3個(gè)月，A組、B組AIBP mRNA表達(dá)明顯低于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組、B組VEGF mRNA高于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組大鼠AIBP免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果(圖4)顯示：AIBP在血管內(nèi)皮層表達(dá)。A組AIBP平均光密度為0.001 6±0.000 2，B組為0.005 0±0.000 2，C組為0.007 1±0.000 5，D組為0.008 0±0.001 8。其中，A組、B組AIBP平均光密度值小于D組(P<0.05)，C組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF蛋白的表達(dá)

圖3 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF mRNA的表達(dá)

圖4 各組大鼠AIBP免疫組化情況

2.5 HUVEC形態(tài) 結(jié)果(圖5)顯示：體外培養(yǎng)下，正常HUVEC呈特征性的鋪路石樣改變；剪應(yīng)力為10 dyn/cm2時(shí)，HUVEC被明顯拉長，沿流體方向排列；剪應(yīng)力為5、2.5、1 dyn/cm2，HUVEC類似扁橢圓型。

2.6 HUVEC細(xì)胞上清液中AIBP、 VEGF及細(xì)胞中總膽固醇含量 結(jié)果(圖6)顯示：與無剪應(yīng)力與剪應(yīng)力為1 dyn/cm2時(shí)相比，剪應(yīng)力為10、5、2.5 dyn/cm2時(shí)，細(xì)胞上清液中AIBP降低、VEGF升高，細(xì)胞中膽固醇總含量升高(P<0.05)。

圖5 HUVEC在不同剪應(yīng)力條件下形態(tài)學(xué)改變

A：剪應(yīng)力為10 dyn/cm2；B：剪應(yīng)力為5 dyn/cm2；C：剪應(yīng)力為2.5 dyn/cm2；D：剪應(yīng)力為1 dyn/cm2；E：無剪應(yīng)力. Original magnification: ×100.n=3

圖6 不同剪應(yīng)力條件下HUVEC中AIBP、 VEGF及總膽固醇的含量表達(dá)

3 討 論

3.1 DAVF模型的建立 人工誘導(dǎo)DAVF的動(dòng)物模型最早由Terade等[7]在1994年通過結(jié)扎大鼠頸外靜脈和頸總動(dòng)脈建立，但該種方法的誘導(dǎo)率較低。之后Herman等[8]通過吻合頸外靜脈和頸總動(dòng)脈，并結(jié)扎上矢狀竇和對(duì)側(cè)橫竇出口，建立靜脈高壓大鼠模型，誘導(dǎo)率提高了40%。Kojima等[9]通過對(duì)比頸動(dòng)脈-頸外靜脈吻合聯(lián)合結(jié)扎對(duì)側(cè)橫竇出口組和單純頸動(dòng)脈-頸外靜脈吻合組發(fā)現(xiàn)，前者術(shù)后即刻的引流靜脈壓力升高至(35±5)mmHg，同時(shí)DAVF的誘導(dǎo)率提高。本課題組前期研究[10]通過建立不同靜脈高壓大鼠模型，構(gòu)建不同梯度的靜脈壓力，結(jié)果提示DAVF的形成與靜脈流出道的壓力梯度正相關(guān)。本研究結(jié)合前期研究及其他研究者的方法[11]，采用以下靜脈端壓力梯度：動(dòng)靜脈吻合+對(duì)側(cè)橫竇閉塞組為15～20 mmHg，單純動(dòng)靜脈吻合組為10～12 mmHg，動(dòng)靜脈結(jié)扎組為1～3 mmHg。

3.2 剪應(yīng)力改變導(dǎo)致VEGF升高的機(jī)制 關(guān)于靜脈高壓誘發(fā)DAVF形成的機(jī)制學(xué)說較多，其中以血管新生機(jī)制研究最多[12]。一般認(rèn)為，靜脈高壓啟動(dòng)了VEGF介導(dǎo)的硬膜血管新生，從而誘導(dǎo)DAVF的發(fā)生和進(jìn)展。靜脈高壓上調(diào)VEGF的機(jī)制中，除低氧誘導(dǎo)因子(HIF)通路[13]外，剪應(yīng)力、壓力、牽張力等機(jī)械刺激在血管新生中也發(fā)揮重要作用[14-15]。

本研究中，靜脈高壓可導(dǎo)致大鼠上矢狀竇的剪應(yīng)力增大，靜脈壓力變化不大時(shí)，可能由于大鼠顱內(nèi)其他靜脈引流的緩沖作用，剪應(yīng)力無明顯變化。剪應(yīng)力與管腔內(nèi)液體流速、管腔直徑及液體黏度等因素有關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)中，剪應(yīng)力的改變主要取決于靜脈竇內(nèi)流速改變。動(dòng)物模型建立后3個(gè)月，靜脈高壓導(dǎo)致的血流分布應(yīng)達(dá)到了新平衡。Western 印跡及real-time PCR提示，靜脈端壓力增高可使VEGF分泌增加，基因表達(dá)上調(diào)，與前期研究[10]相符，進(jìn)一步提示靜脈高壓導(dǎo)致的剪應(yīng)力增大可能與VEGF表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

內(nèi)皮細(xì)胞為血管壁的最內(nèi)層，直接與血流接觸，可以較為敏感地感知血液中炎癥因子、激素變化及血管的機(jī)械刺激。HUVEC傳代多次仍可保證細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，不易發(fā)生變性。本研究選擇HUVEC進(jìn)行進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)。該部分實(shí)驗(yàn)中，以剪應(yīng)力為唯一變量，排除靜脈高壓造成的其他影響，包括缺氧、靜水壓力等改變，且實(shí)驗(yàn)對(duì)象單一穩(wěn)定，個(gè)體差異小，同時(shí)較其他研究[16]增加了實(shí)驗(yàn)組組數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無機(jī)械刺激時(shí)，HUVEC呈典型的鋪路石樣生長，剪應(yīng)力升高時(shí)，細(xì)胞被拉長，提示剪應(yīng)力是影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能改變的重要因素。

內(nèi)皮細(xì)胞將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，介導(dǎo)血管新生的機(jī)制尚不明確。有學(xué)者[14]認(rèn)為，Cl-通道在該過程中發(fā)揮重要作用。也有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)，剪應(yīng)力作用下，內(nèi)皮細(xì)胞中整合素、FLK-1等表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞黏附能力和抗凋亡能力升高，進(jìn)而啟動(dòng)血管新生。dela Paz等[16]發(fā)現(xiàn)，與無剪應(yīng)力培養(yǎng)相比，HUVEC在高剪應(yīng)力下培養(yǎng)72 h后，VEGF表達(dá)明顯上調(diào)，其 mRNA上調(diào)了5倍，且VEGFR的表達(dá)量及磷酸化水平也分別升高為無剪應(yīng)力時(shí)的4倍和6倍。本研究中，剪應(yīng)力為10、5、2.5 dyn/cm2時(shí)，VEGF分泌明顯增加，與dela Paz等的結(jié)果相符。但剪應(yīng)力為1 dyn/cm2時(shí)，VEGF表達(dá)無明顯差異，分析原因可能：(1)剪應(yīng)力變化不大時(shí)，機(jī)械刺激不足以通過啟動(dòng)細(xì)胞膜上相應(yīng)的門控通道來調(diào)控VEGF；(2)內(nèi)皮細(xì)胞除受到血管內(nèi)各種機(jī)械、生物刺激外，血管壁平滑肌細(xì)胞對(duì)其形態(tài)、功能也有影響，單一的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與2種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的生物環(huán)境差異也可能導(dǎo)致結(jié)果不同。

3.3 膽固醇代謝導(dǎo)致血管新生機(jī)制 膽固醇對(duì)于維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及各項(xiàng)功能的運(yùn)行至關(guān)重要，但過量的膽固醇可加重細(xì)胞的代謝負(fù)荷。細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)膽固醇代謝的2種關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 A1(ABCA1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 G1(ABCG1)，在細(xì)胞調(diào)控、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過程中均發(fā)揮作用。在調(diào)節(jié)膽固醇運(yùn)輸過程中，ABCA1主要促進(jìn)膽固醇運(yùn)輸至細(xì)胞外的載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)， ABCG1 則介導(dǎo)膽固醇運(yùn)輸至成熟的高密度脂蛋白。研究[17]發(fā)現(xiàn)，apoA-Ⅰ可通過 ABCG1 促使膽固醇從細(xì)胞膜的脂筏流向細(xì)胞外，該過程抑制 CD40L/CD40 介導(dǎo)的促炎效應(yīng)，提示膽固醇流出可能參與多種生物學(xué)功能。 Terasaka等[18]發(fā)現(xiàn)，ABCG1 和高密度脂蛋白通過調(diào)控內(nèi)皮型一氧化氮合酶來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)而提高血管通透性，導(dǎo)致炎性細(xì)胞滲透入組織，該過程可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的病理性血管新生。而最新針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究[19-20]指出，高剪應(yīng)力條件下一氧化氮可下調(diào)ABCA1，而低剪應(yīng)力條件下 ABCA1 的表達(dá)相對(duì)增高。此外，剪應(yīng)力可使細(xì)胞內(nèi)多種蛋白亞硝基化，從而起到與NO類似的作用，最終導(dǎo)致產(chǎn)生內(nèi)皮微粒，這可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要通路。

膽固醇升高啟動(dòng)VEGF介導(dǎo)的血管新生機(jī)制目前仍不明確。Fang等[6]研究者指出AIBP和高密度脂蛋白共同參與膽固醇代謝，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇向胞外流出，阻斷 VEGF 介導(dǎo)的血管新生通路。本研究結(jié)果顯示，高剪應(yīng)力導(dǎo)致AIBP分泌減少，基因表達(dá)下調(diào)，提示AIBP可能在血管剪應(yīng)力作用下，通過減少細(xì)胞膜上的膽固醇流出，促進(jìn)VEGF介導(dǎo)的血管新生。但是，靜脈端壓力增加后，除了剪應(yīng)力的改變，上矢狀竇內(nèi)的靜水壓力、牽張力等也會(huì)發(fā)生變化，且靜脈高壓會(huì)造成腦組織低灌注，誘發(fā)缺血缺氧，這些因素均可導(dǎo)致膽固醇代謝紊亂，從而啟動(dòng)VEGF調(diào)控的血管新生。

本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，排除靜水壓、組織缺血缺氧等因素干擾后，高剪應(yīng)力條件培養(yǎng)時(shí)，HUVEC分泌AIBP明顯減少，并使膽固醇向胞外流出減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇含量增加，而對(duì)應(yīng)的細(xì)胞分泌VEGF升高，與Fang等[6]的研究結(jié)果相符。

綜上所述，靜脈高壓造成的剪應(yīng)力改變可以調(diào)控大鼠硬膜組織中VEGF及AIBP的表達(dá)水平，AIBP可能通過調(diào)控膽固醇代謝調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管新生。本實(shí)驗(yàn)的局限性在于：調(diào)控VEGF表達(dá)通路多而復(fù)雜，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未排除剪應(yīng)力之外的其他因素的影響；體外實(shí)驗(yàn)顯示剪應(yīng)力改變可以調(diào)控AIBP的表達(dá)，但不能明確AIBP調(diào)控的膽固醇增加是調(diào)控VEGF上調(diào)的重要通路，還是VEGF上調(diào)的伴隨現(xiàn)象。后續(xù)研究將借助基因工程學(xué)等技術(shù)沉默AIBP基因或使其過表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證其是否對(duì)VEGF存在直接調(diào)控作用。