吳銳，潘茲書

1. 貴州省人民醫(yī)院生殖中心，貴陽 550002; 2. 武漢大學生命科學學院/病毒學國家重點實驗室，武漢 430072

豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)為黃病毒科瘟病毒屬成員，是引起豬急性、發(fā)熱性與接觸性傳染病——豬瘟的病原體。CSFV基因組為1條長約12.3 kb的單股正鏈RNA，包括位于兩端的非編碼區(qū)和中間編碼多聚蛋白的開放讀碼框。多聚蛋白經(jīng)過細胞與病毒的蛋白酶加工后形成4個結構蛋白和8個非結構蛋白。

CSFV 4種結構蛋白分別是核衣殼Core蛋白、包膜蛋白Erns、E1和E2[1]。Core蛋白在基因組編碼的多聚蛋白上位于N端蛋白酶Npro與糖蛋白Erns之間。Core蛋白的成熟包括Npro蛋白酶水解多聚蛋白，形成Core蛋白的N端及細胞信號肽酶加工產(chǎn)生Core蛋白的C端[2-4]。通過Core蛋白缺失突變體的CSFV感染性cDNA克隆，研究人員發(fā)現(xiàn)Core蛋白的N端與C端在病毒顆粒形成中發(fā)揮重要作用[5]。用缺失Core蛋白的CSFV感染性cDNA克隆轉染細胞，連續(xù)傳代后獲得的NS3突變以補償Core蛋白缺失的功能，產(chǎn)生的CSFV毒力降低[6]，表明Core蛋白在決定CSFV毒力中有重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，對Core蛋白的SUMO化位點或IQGAP1相互作用位點進行突變，可導致CSFV毒力減弱[7-8]。研究表明Core蛋白對病毒的包裝及其毒力具有十分重要的作用，但目前關于Core蛋白在細胞中的定位與功能的關系研究報道相對較少。本實驗通過研究Core蛋白、截短突變體及氨基酸位點突變體在細胞中的定位，發(fā)現(xiàn)Core蛋白的核仁定位序列為PESRKKL，關鍵氨基酸為R76K77。

1 材料與方法

1.1 材料

pEGFP-C1質粒和PK15細胞為本實驗室保存，大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α感受態(tài)細胞為本實驗室制備，EcoRⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自Thermo Fisher公司，質粒提取試劑盒與DNA凝膠回收試劑盒購自Promega公司，LipofectamineTM 2000購自Invitrogen 公司，DAPI購自 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pEGFP-Core及Core蛋白突變體的構建根據(jù)CSFV石門株基因組序列(NCBI NO.AF092448.2)，設計擴增Core基因及其突變體的引物，在引物兩端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。以CSFV石門株感染性cDNA克隆為模板，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增Core蛋白基因及其截短突變體。將擴增得到的DNA片段和pEGFP-C1質粒用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后回收，并用T4連接酶進行連接，獲得pEGFP-Core及其截短的重組質粒。利用重疊PCR擴增法獲得Core蛋白基因點突變DNA片段，采取上述重組質粒構建方法獲得了pEGFP-Core突變體。重組質粒由上海生工生物工程公司進行測序鑒定。

1.2.2 轉染提取足量的pEGFP-C1、pEGFP-Core蛋白及其突變體的重組質粒。將培養(yǎng)狀態(tài)良好的PK15細胞種植于35 mm細胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)6 h 左右。當細胞匯合度約80%～90%時，用LipofectamineTM 2000進行轉染。具體操作：分別配置A液(3 μg質粒、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基)和B液(10 μL LipofectamineTM 2000、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基)，室溫孵育5分鐘后，混勻A液與B液，繼續(xù)室溫孵育20分鐘，加到含有細胞和培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中并混勻。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察亞細胞定位將重組質粒轉染24 h后的PK15細胞用PBS清洗，經(jīng)甲醇-丙酮固定液(1∶1)固定后，DAPI染色。LAS AF Lite 4.0共聚焦熒光顯微鏡(Leica, Germany)下進行觀察。

2 結果

2.1 Core蛋白定位于胞質及核仁

為研究CSFV Core蛋白在PK15細胞的定位分布情況，構建重組真核表達質粒pEGFP-Core，轉染到PK15細胞后觀察Core蛋白與EGFP融合蛋白的表達及細胞定位。結果顯示，對照組EGFP均勻分布于整個細胞，而在轉染重組質粒pEGFP-Core的PK15細胞的EGFP-Core除胞質定位外還具有明顯的核仁定位分布(圖1)，這與早期Core蛋白核仁定位的研究結論一致[9]。

2.2 Core蛋白核仁定位序列為PESRKKL

為鑒定Core蛋白核仁定位序列，構建3個pEGFP-Core截短突變體重組質粒(圖2A)。將重組質粒分別轉染至PK15細胞，熒光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示，EGFP-Core M1與EGFP定位情況類似，表明Core M1不存在定位Core蛋白的特異序列；EGFP-Core M2與EGFP-Core定位情況類似，存在明顯的核仁定位，表明Core蛋白的核仁定位序列位于Core蛋白的第36位與第81位氨基酸之間；EGFP-Core M3只定位在胞質內(nèi)，沒有細胞核仁定位(圖2B)。

為進一步確認Core蛋白的核仁定位序列，利用PSORTII計算機程序(https://psort.hgc.jp/form2.html)對Core M2進行核仁定位序列分析。分析結果顯示，73～79位氨基酸序列(PESRKKL)可能是潛在的核仁定位序列。為了驗證PESRKKL序列是否是Core蛋白核仁定位的關鍵序列，構建了pEGFP-Core M4(Δ73～79)重組質粒，并將其轉染到PK15細胞。熒光顯微鏡顯示，EGFP-Core M4(Δ73～79)沒有核仁定位(圖2B)， 表明PESRKKL序列是CSFV Core蛋白核仁定位的關鍵序列。

圖1 CSFV Core蛋白在PK15細胞的定位分析

Fig.1 Analyze the localization of CSFV Core protein in PK15 cells

A: Amino acids sequence of CSFV Core and its truncated mutants diagram. B: Immunofluorescence analysis of truncated CSFV Core protein in PK15 cells.

圖2 CSFV Core蛋白、截短突變體的亞細胞定位

Fig.2 Subcellular localization of truncated CSFV Core mutants

2.3 Core蛋白核仁定位的關鍵氨基酸為R76K77

為進一步定位Core蛋白核仁定位序列的關鍵氨基酸，將Core蛋白核仁定位序列的氨基酸依次突變?yōu)楸彼?圖3A和圖3B)。結果發(fā)現(xiàn)，PESRKKL序列的單個氨基酸突變并不影響Core蛋白的核仁定位(圖3C)。

根據(jù)黃病毒科其他病毒Core蛋白的核仁定位序列研究，推測PESRKKL序列的連續(xù)2個堿性氨基酸序列可能是該序列核仁定位的關鍵氨基酸。因此，構建了EGFP-Core的突變體R76A/K77A(圖3A和圖3B)。觀察發(fā)現(xiàn)，突變體R76A/K77A不存在核仁定位(圖3C)。以上結果表明R76K77是決定Core蛋白核仁定位的關鍵氨基酸。

A: Core mutants with indicated amino acids mutation and its localization in PK15 cells. B: The alignment of sequencing results of Core mutants. C: Immunofluorescence analysis of Core mutants localization in PK15 cells.

圖3 CSFV Core蛋白核仁定位的關鍵氨基酸鑒定

Fig.3 Identification of critical amino acids for nucleolus localization of CSFV Core

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CSFV Core蛋白的核仁定位序列位于73PESRKKL79。已有研究報道，CSFV Core蛋白的一個核仁定位序列位于51KKKGKV56[9]。因此,我們推測CSFV Core蛋白至少具有兩個核仁定位序列，缺失其中任何一個核仁定位序列都將導致Core蛋白的核仁定位功能喪失。

已有的研究表明，黃病毒科成員核心蛋白具有一個或多個核仁定位序列，對這些核仁定位序列進行的突變都嚴重影響病毒的包裝與復制。例如，乙型腦炎病毒Core蛋白的G42P43[10]，登革病毒Core蛋白的K73K74A和R85K86[11]以及丙型肝炎病毒Core蛋白第5～13、38～43和112～117位氨基酸[12]都是決定Core蛋白核仁定位的關鍵氨基酸。那么CSFV Core蛋白的核仁定位對病毒復制具有怎樣的意義？有文獻報道，缺失Core蛋白第51～57位或第71～78位氨基酸分別導致轉染感染性克隆24 h后病毒滴度降低87.5%和93.75%[5]。可見，CSFV Core的核仁定位對病毒顆粒具有一定的影響。而Core蛋白核仁定位序列的缺失對病毒基因組的復制與病毒毒力的影響尚未可知，有待進一步的研究。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，第82～99位氨基酸序列具有較強的疏水性。研究結果顯示，EGFP-Core M3第82～99位氨基酸定位在胞質而沒有細胞核仁定位，提示Core蛋白第82～99位氨基酸序列定位于細胞質而發(fā)揮作用。在黃病毒科的其他病毒也有類似報道，如丙型肝炎病毒Core蛋白的疏水結構域第109～133位氨基酸是Core蛋白從細胞核轉運到細胞質的重要出核信號序列，突變其中的疏水氨基酸都將導致Core蛋白的核仁定位減少[13]；登革病毒Core蛋白通過其內(nèi)部疏水序列第46～66位氨基酸定位到內(nèi)質網(wǎng)膜上，使得病毒顆粒與內(nèi)質網(wǎng)膜相關聯(lián)[14]。登革病毒Core蛋白的內(nèi)部疏水序列將病毒顆粒牽引到內(nèi)質網(wǎng)膜形成的脂滴上，促進病毒基因組的復制，從而影響登革病毒的復制[15]。位于CSFV Core蛋白第82～99位氨基酸促進Core蛋白的核仁定位對病毒復制與包裝具有怎樣的功能還有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過分析Core蛋白、截短突變體及氨基酸位點突變體與EGFP融合蛋白在PK15細胞中的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)了CSFV Core蛋白核仁定位序列和關鍵氨基酸位點，為進一步研究CSFV Core蛋白結構與功能及其在病毒復制和組裝中的作用提供了依據(jù)。