汪珊 朱瑾 何巖 黃民生 周運昌

摘要：通過探究不同濃度硫化物對黑臭河道底泥反硝化過程的影響，同時分析底泥細菌、反硝化菌和硫酸鹽還原菌的響應變化，為強化底泥反硝化脫氮提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐.研究結(jié)果表明：較低濃度的硫化物（8 mg.L^-1）對底泥反硝化潛勢無明顯影響;適宜濃度的硫化物（40和64 mg.L^-1）對底泥反硝化有明顯的促進作用，且濃度越高促進作用越明顯;當硫化物濃度升高到96 mg.L^-1及以上時，還原態(tài)硫?qū)Ψ聪趸^程起抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯.底泥經(jīng)過一段時間的反硝化培養(yǎng)，細菌多樣性以變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門為主;同時，底泥細菌總數(shù)明顯增加，代謝菌群的nirS豐度比、dsrB豐度比分別為1.42%和0.05%，相較原始底泥（0.15%，0.19%），反硝化細菌增值明顯，但硫酸鹽還原菌數(shù)量有所下降.

關(guān)鍵詞：黑臭河道;還原態(tài)硫;反硝化;底泥

中圖分類號：X522

文獻標志碼：A

DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2019.04.015

0 引言

隨著黑臭河道整治工作的相繼開展，河道黑臭現(xiàn)象得到了有效控制，但總氮去除率偏低問題逐漸凸顯，氮營養(yǎng)鹽難以去除成為黑臭河道治理過程中亟待解決的突出問題.硫元素是河道生態(tài)系統(tǒng)的重要元素，由于水體中硫化物的高度不穩(wěn)定性，其對氮素削減過程的影響作用往往被屏蔽.此外，現(xiàn)階段關(guān)于硫?qū)Ψ聪趸饔玫难芯窟€存在分歧.一方面，硫化物可能耦合硝酸鹽還原過程，促進硫自養(yǎng)反硝化的發(fā)生[1-2]：另一方面，高濃度的硫化物會通過抑制一氧化氮（NO）和一氧化二氮（N20）還原酶的活性來阻礙反硝化過程的進行[3-4]，但尚不明確還原態(tài)硫?qū)Ψ聪趸绊懽饔玫臐舛认拗?因此，探究硫化物對黑臭河道底泥反硝化潛勢的影響機制可為強化底泥反硝化脫氮提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗所需的河道底泥和上覆水均采集于上海市桃浦區(qū)里店浦，該河為上海市工業(yè)河的一條支流，受沿岸排污口影響不斷納入污水，污染情況嚴重，河水的水動力條件較差，自凈能力較弱，是典型的城市黑臭河道.采樣河道的位置如下圖1所示，

里店浦底泥的基本理化性質(zhì)：底泥酸可揮發(fā)硫化物（AVS）含量為122.7 μmol.g^-1，底泥總鐵含量為19.7 9.kg^-1.

1.2 實驗裝置

將取回的底泥置于500 mL血清瓶中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液和微量元素溶液[11]，河道底泥與液體培養(yǎng)基比例為1：10，添加相應濃度的硫化物（Na2S.9H20，分析純）和硝酸鹽氮（KN03，分析純），密封遮光處理后置于30。C恒溫箱中培養(yǎng).

為探究不同硫化物濃度對自養(yǎng)反硝化的影響，設置實驗組1 5（見表1），分別設置硫化物溶液為0、8、40、64和96 mg.L.1進行反硝化培養(yǎng)實驗（此前預實驗已知8和40mg.L.1對反硝化有促進作用，96 mg.L^-1起抑制作用）.

在培養(yǎng)期間，定期取樣測定NH4-N、N02 -N、N03-N、S2-和S02-的濃度.每當測定的S2-和N02 -N濃度低于檢測限時，更換培養(yǎng)液，同時向血清瓶中添加相應基質(zhì).

1.3 高通量測序及熒光定量PCR的測定

硫自養(yǎng)反硝化實驗各組趨于穩(wěn)定時，將根據(jù)理化指標分析，選取關(guān)鍵實驗組中的底泥進行細菌通用引物和基于功能基因16S rDNA、nirS、dsrB的高通量測序分析及熒光定量PCR測定分析，以解析底泥細菌、反硝化和硫酸鹽還原菌群豐度及結(jié)構(gòu)的響應變化.高通量測序與熒光定量測定所用引物如下表2所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 硫化物濃度對底泥反硝化作用的影響

不同硫化物濃度對反硝化過程的影響不同.圖2是比較各實驗組硝酸鹽的濃度變化，從圖上直線的下降水平可以看出，硫化物濃度為8 mg.L^-1、40 mg.L^-1和64 mg.L^-1的實驗組硝酸鹽還原速率高于不加硫化物的空白對照組，并且硫化物濃度為64 mg.L^-1的實驗組硝酸鹽還原速率最快，其次是40 mg.L^-1和8 mg.L^-1，即硫化物濃度越高，硝酸鹽還原速率越快，且底泥培養(yǎng)體系在10～14 d內(nèi)硝酸鹽的還原率均可達到98%以上.相比不添加硫化物的培養(yǎng)組（對照組），8 mg.L^-1的硫化物對反硝化促進作用不明顯;40 mg.L^-1的硫化物對反硝化有促進作用但在第3個培養(yǎng)周期后才顯現(xiàn)出，平均每個培養(yǎng)周期的第6天硝酸鹽還原率即可達到98%以上;64 mg.L^-1的硫化物對反硝化有明顯的促進作用且平均每個培養(yǎng)周期的第3天硝酸鹽還原率即可達到98%以上（見表3）.實驗組5硫化物濃度為96 mg.L^-1，硝酸鹽的還原速率明顯低于空白組，反硝化過程一直被抑制，一個培養(yǎng)周期結(jié)束時反應體系內(nèi)硝酸鹽的濃度約為（6.62±0.03）mg.L-1，抑制率約為23.64%;實驗組2后期硫化物濃度升高至160 mg.L^-1（從第6個培養(yǎng)周期開始），硝酸鹽的還原速率明顯降低，同時一個培養(yǎng)周期結(jié)束時反應體系內(nèi)硝酸鹽的濃度約為（9.52±0.22）mg.L^-1，第6～8個培養(yǎng)周期硝酸鹽還原抑制率約為34%.

由此可見，較低濃度的硫化物（S2-濃度不高于64 mg.L^-1）對反硝化過程起一定的促進作用，且濃度越高促進作用越明顯，推測可能出現(xiàn)了硫自養(yǎng)反硝化的發(fā)生[7] S2-作為電子供體加速硝酸鹽的還原過程：而高濃度硫化物對底泥的反硝化過程有抑制作用，其原因主要是硫化物對一氧化氮（NO）和一氧化二氮（N20）還原酶的活性有抑制從而阻礙的反硝化進程[6].

此外，高濃度硫化物實驗組后期出現(xiàn)較明顯的氨氮積累（見圖3）.S2-濃度為96 mg.L^-1和160 mg.L^-1的底泥培養(yǎng)組氨氮濃度明顯高于其他實驗組，氨氮積累濃度分別為（3.94±0.16）mg.L^-1和（4.46±0.14）mg.L^-1，同時亞硝氮積累濃度分別為（4.02±0.15）mg.L^-1和（2.82±0.13）mg.L^-1，但積累的亞硝氮會在每個培養(yǎng)周期結(jié)束時消耗完畢，推測實驗中可能存在異化硝酸鹽還原過程（Dissimilatory nitrate reduction to ammoumum，DNRA），硫化物濃度較高會抑制反硝化并作為電子供體參與呼吸型DNRA過程[8].

不同硫化物濃度下各實驗組硫化物和硫酸鹽濃度變化有明顯差異（見圖3）.當S2-濃度小于或等于64 mg.L^-1時，一個培養(yǎng)周期結(jié)束時硫酸鹽SO4一的平均濃度隨所添加硫化物濃度的增加而升高.S2-濃度為40 mg.L^-1和64 mg.L^-1時，每個培養(yǎng)周期結(jié)束時SO4一濃度分別為（241.5±2.6）mg.L^-1和（306.5土4.4）mg.L^-1.S2一濃度升高至96 mg.L^-1和160 mg.L^-1，硫酸鹽濃度卻沒有升高，推測其原因可能是高濃度硫化物未能促使硫自養(yǎng)反硝化的發(fā)生，部分還原態(tài)的硫未能通過該反應生成硫酸鹽并積累.

2.2 硫影響底泥反硝化過程的關(guān)鍵菌群群落結(jié)構(gòu)及豐度響應

本實驗選取實驗組3（硫化物濃度為40 mg.L^-1，硝酸鹽28 mg.L^-1）、原始底泥、對照組（未添加硝酸鹽，硫化物濃度為40 mg.L^-1）來進行高通量及熒光定量PCR分析，實驗組3是按硫自養(yǎng)反硝化計量比添加的硫化物濃度，上覆水實驗也測得該組反硝化作用得到顯著促進，而對照組是為了排除硫化物本身對微生物的影響，對比可得硫自養(yǎng)反硝化作用過程中微生物群落特點.

借助于高通量及熒光定量PCR探究底泥培養(yǎng)實驗組3的底泥中與氮硫代謝相關(guān)微生物的豐度與結(jié)構(gòu)響應變化，以期望進一步解析硫?qū)Φ啄喾聪趸瘽摿Φ挠绊?

2.2.1 底泥氮硫代謝相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)的響應變化

培養(yǎng)組底泥細菌多樣性與對照組有明顯差異（見表4）.實驗組3（硫化物40 mg.L^-1）細菌的OTU數(shù)、Chaol、Shannon和Simpson指數(shù)均低于對照培養(yǎng)組（硫化物40 mg.L^-1，未添加硝酸鹽）.原因可能是實驗組發(fā)生反硝化作用，微生物以自養(yǎng)細菌為主，而自養(yǎng)細菌世代周期較長、增殖較慢，因此豐富度偏低.

根據(jù)底泥結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果（見圖4），反硝化培養(yǎng)組底泥細菌多樣性以變形菌門（Proteobac-teria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和嗜熱絲菌門（Caldiserica）為主;對照組底泥細菌以變形菌門（Proteobacte-ria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主.變形菌門（Proteobacteria）在實驗組3和對照培養(yǎng)組底泥中的相對豐度分別為53.75%和28.31%;綠彎菌門（Chloroflexi）在各培養(yǎng)組底泥中的相對豐度分別為22.96%和37.45%;擬桿菌門（Bacteroidetes）在各培養(yǎng)組底泥中的相對豐度為13.21%和21.61%（見表5）.在為期近100 d的培養(yǎng)后，實驗組3底泥的變形菌門（Proteobacteria）遠遠高于對照培養(yǎng)組底泥，分析可能是長時間反硝化潛力的培養(yǎng)使得底泥反硝化細菌（隸屬于變形菌門）活性提高且數(shù)量增加，而對照培養(yǎng)組培養(yǎng)過程中只添加了硫化物，沒有硝酸鹽作為電子受體供反硝化細菌利用，因此其反硝化細菌的活性相對較低.

基于功能基因nirS檢測，實驗組3底泥的優(yōu)勢硫自養(yǎng)反硝化菌為硫桿菌屬（Thiobacillus）與硫針菌屬（Sulfuritalea）分別占21.5%與4.85%.對照培養(yǎng)組優(yōu)勢硫自養(yǎng)反硝化菌為硫桿菌屬（Thiobacillus）與硫針菌屬（Sulfuritalea），分別占2.43%和0.805.硫桿菌屬（Thiobacillus）是最常見且研究最為廣泛的硫自養(yǎng)反硝化菌[27].實驗組3底泥中的硫桿菌屬（ Thiobacillus）的相對豐度（21.5%）遠高于對照培養(yǎng)組，表明該體系中硫自養(yǎng)反硝化活性很高，與促進反硝化作用分析一致.另外，帕氏氫噬胞菌（llydrogenophaga）和苯基桿菌屬（Phenylobacterium）在該培養(yǎng)組中相對豐度較高，上述菌屬的主要功能分別是多環(huán)芳烴的降解和石油烴及一些混合烴的降解，推測是培養(yǎng)組中反硝化菌為自養(yǎng)細菌，為其他降解有機物的細菌提供了更適宜的生成空間.對于反硝化細菌，實驗組3底泥中主要的反硝化細菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）與陶厄氏菌屬（Thauera）分別占1.78%與14.3%;在只添加硫化物的對照培養(yǎng)組底泥中分別占2.38%和14.6%.實驗組底泥的核心反硝化菌屬為陶厄氏菌屬（Thauera）、假單胞菌（Pseudomonas）、貪銅菌屬（Cupriavidus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）和副球菌（Paracoccus）.

基于功能基因dsrB分析底泥硫酸鹽還原菌可知：實驗組3底泥中的硫酸鹽還原菌主要為脫硫微菌屬（Desulfomicrobium）與脫硫腸狀菌屬（Desulfotomaculum），分別占0.56%與15.3%;在只添加硫化物的對照培養(yǎng)組底泥中分別占1.18%和5.65%.可以看出實驗組脫硫腸狀菌屬含量明顯小于對照培養(yǎng)組，推測可能實驗組反硝化作用得到促進，反硝化細菌與硫酸鹽還原菌競爭激烈，不利于硫酸鹽還原，導致該菌屬含量明顯下降.

2.2.2 底泥氮硫代謝相關(guān)菌群豐度的響應變化

在為期近100 d的培養(yǎng)后，底泥細菌總數(shù)明顯增加.實驗組3中的細菌數(shù)量由初始的1.06x109 copies/g dry sediment增加至2.6lx109copies/g dry sediment，底泥細菌數(shù)量較培養(yǎng)之前的細菌數(shù)增加了約1.5倍.表明對河道底泥較長時間反硝化潛力的培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)體系底泥中細菌的增殖，細菌數(shù)量有大幅度增加，活性也響應會有大幅度增加.

培養(yǎng)后的底泥反硝化細菌數(shù)量明顯增加，而硫酸鹽還原菌數(shù)量有所下降，實驗組3中的反硝化細菌數(shù)量由初始的1.58x10⁶copies/g dry sediment增加至3.7lx107copies/g dry sediment，底泥反硝化細菌數(shù)量較培養(yǎng)之前的反硝化細菌數(shù)增加了約22倍.硫酸鹽還原細菌數(shù)量由初始的1.99x10⁶copies/g dry sediment降至1.32x10⁶copies/g dry sediment.根據(jù)實驗結(jié)果（見表6）也可得實驗組3底泥代謝菌群與原始底泥的nirS豐度比、dsrB豐度比，相比之下可以看出，底泥在40 mg.L^-1硫化物的條件下培養(yǎng)一段時間，nirS豐度比明顯上升，而dsrB豐度比則有一定程度下降.上述現(xiàn)象均表明添加40 mg.L^-1硫化物培養(yǎng)，有利于硝化細菌的增值，而硫酸鹽還原菌的增值受到抑制.硫酸鹽還原菌與硝酸鹽還原菌共同競爭為電子供體，存在競爭關(guān)系，硝酸鹽還原菌的增值可能一定程度上抑制硫酸鹽還原菌的生長，導致數(shù)量下降.周期性地向培養(yǎng)體系內(nèi)添加硫化物與硝酸鹽，有利于硫自養(yǎng)反硝化細菌的生長與富集.

3 結(jié)論與展望

本實驗探究了硫化物對黑臭河道底泥反硝化作用潛勢.當硫化物濃度控制在64 mg.L^-1以下時，還原態(tài)的硫會對反硝化過程起促進作用，硝酸鹽還原率可達98%以上，且S2-濃度越高硝酸鹽還原速率越快，反硝化過程越短.當還原硫濃度升高到96 mg.L^-1及以上時，還原態(tài)硫?qū)Ψ聪趸^程起抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯.同時，添加適宜濃度的硫化物（40 mg.L^-1）培養(yǎng)一段時間，細菌總數(shù)明顯增加，尤其是反硝化細菌的增加量達到原來的22倍，同時一定程度上抑制了硫酸鹽還原菌的生長，總體上細菌總數(shù)增加，對反硝化過程起促進作用.

實驗結(jié)果表明當硫化物濃度控制在64 mg.L^-1以下會對反硝化作用起促進作用，濃度高于96 mg.L^-1對反硝化起抑制作用，但是64～96 mg.L^-1之間相應情況未知，需要進一步設置濃度梯度，探究最佳促進濃度和抑制限值，從而更有效地進行硫自養(yǎng)反硝化，提高脫氮除硫效率，為黑臭河道治理工程提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐，緩解城市黑臭河道現(xiàn)象.

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