劉寅寅， 鄒盼盼， 朱鶯鴿， 賀 焱， 張夢娟， 陳 超， 劉 暢， 李 磊

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

炎癥反應是多種疾病共同的發(fā)病基礎或病理過程,會造成局部或全身的損傷,嚴重時可危及生命。一些傳統(tǒng)中藥的提取物如雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯抗炎效果較好。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)是從雷公藤根中提取的總苷,用于腎臟疾病[1]、重癥肝炎、紅斑狼瘡等疾病的治療,具有顯著的抗炎及免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[2],對類風濕疾病的治療效果甚佳[3],但由于其存在毒性,尤以肝毒性較大[4],限制了其臨床應用。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,Andro)作為穿心蓮中的主要有效成分,具有清熱解毒、去腫止痛、抗炎抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)作用的同時,保肝利膽效果顯著[5-6]。因此,本研究將嘗試利用穿心蓮內(nèi)酯保肝作用來改善雷公藤多苷的肝毒性,通過小鼠耳腫脹試驗、醋酸扭體試驗、熱板反應和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導炎癥模型來研究、比較穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷單獨使用與配伍使用的抗炎效果,以期判斷兩者配伍的可行性和臨床應用價值,為穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷配伍使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 體重18～22 g的ICR小鼠,由安徽科技學院實驗動物中心提供,于室溫下飼養(yǎng),試驗期間小鼠自由進食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑 羧甲基纖維素鈉(批號:F20050621)購于國藥集團化學試劑有限公司;穿心蓮內(nèi)酯(批號:C10064882)購于上海麥克林生化科技有限公司;雷公藤多苷片(批號:171103)購于上海復旦復華藥業(yè)有限公司;醋酸地塞米松片(批號:160402)購于浙江仙琚制藥股份有限公司;二甲苯(批號:20170502)購于江蘇強盛功能化學股份有限公司;冰乙酸(批號:C10101190)購于上海麥克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS,批號:813Q037)購于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器設備 RB-200智能熱板儀 (成都泰盟科技有限公司);LE204E電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司);IMS-70全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 耳腫脹試驗 選擇30只小鼠適應性飼養(yǎng)7 d,隨機分為模型組、地塞米松組、雷公藤多苷組、穿心蓮內(nèi)酯組、穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷配伍組,每組6只。模型組按照0.1 mL/10 g灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液;地塞米松組按照2 mg/kg灌胃地塞米松;雷公藤多苷組按照30 mg/kg灌胃雷公藤多苷;穿心蓮內(nèi)酯組按照20 mg/kg灌胃穿心蓮內(nèi)酯;穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷配伍組同時灌胃30 mg/kg的雷公藤多苷和20 mg/kg的穿心蓮內(nèi)酯。連續(xù)灌胃5 d,于最后1 d灌胃結(jié)束1 h后,將每只小鼠右耳前后均勻涂抹0.02 mL二甲苯,30 min后,將小鼠頸椎脫臼處死,沿小鼠耳廓基線剪下雙耳,并用8 mm的打孔器分別于左右兩耳相同位置剪下一圓片,立即用分析天平準確稱量左右耳片重量,計算耳片腫脹抑制率。

耳片腫脹率(%)=(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)/左耳片質(zhì)量×100%

耳片腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹率-藥物組平均腫脹率)/模型組平均腫脹率×100%[7]

1.2.2 醋酸扭體試驗 取30只雌性ICR小鼠適應性飼養(yǎng)7 d,隨機分為空白組、地塞米松組(2 mg/kg)、雷公藤多苷組(30 mg/kg)、穿心蓮內(nèi)酯組(20 mg/kg)、穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷配伍組(20 mg/kg+30 mg/kg),每組6只?？瞻捉M按照0.1 mL/10 g灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,其余各組給予相應藥物,連續(xù)灌胃5 d,于最后1 d灌胃結(jié)束30 min后,按照0.1 mL/10 g給小鼠注射0.7%的醋酸溶液,觀察記錄20 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù),并計算鎮(zhèn)痛百分率。

鎮(zhèn)痛百分率(%)=[1-(給藥組平均扭體數(shù)/空白組平均扭體數(shù))]×100%

1.2.3 熱板試驗 小鼠分組與給藥同醋酸扭體試驗。連續(xù)灌胃5 d,最后1 d灌胃結(jié)束30 min后,將小鼠置于55±5 ℃的熱板儀測定其痛閾值(將小鼠放于熱板儀上至出現(xiàn)舔足和抖足的時間作為痛閾值(s)),共測定2次,取均值。如60 s仍然沒有反應,將小鼠取出,以免燙傷,其痛閾值算作60 s。

1.2.4 LPS誘導小鼠炎癥試驗 取ICR小鼠30只,雌雄各半,按照體重均衡隨機分為空白組、炎癥模型組、雷公藤多苷組(30 mg/kg)、穿心蓮內(nèi)酯組(20 mg/kg)、穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷配伍組(20 mg/kg+30 mg/kg),每組6只。炎癥模型組和空白組按照0.1 mL/10 g·b·w 灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,藥物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制,每天灌胃1次,連續(xù)5 d。最后1 d灌胃30 min后,除空白組外,均按照5 mg/kg體重腹腔注射脂多糖,6 h后摘眼球取血,檢測其血常規(guī)和血液生化指標,觀察穿心蓮內(nèi)酯與雷公藤多苷單獨及其配伍使用對LPS誘導炎癥小鼠的保護作用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標準誤”表示,采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA檢驗,多重比較采用LSD檢驗,P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷對小鼠耳腫脹率的影響

如表1所示,與模型組相比,雷公藤多苷組、穿心蓮內(nèi)酯組均能顯著地抑制二甲苯所以引起的小鼠耳腫脹(P<0.05),地塞米松組、配伍組均能極顯著地抑制二甲苯所以引起的小鼠耳片腫脹(P<0.01);與雷公藤多苷組、穿心蓮內(nèi)酯組相比配伍組雖能抑制二甲苯所以引起的小鼠耳片腫脹,但無顯著性差異?？梢娎坠俣嘬蘸痛┬纳弮?nèi)酯配伍使用,抗炎效果優(yōu)于穿心蓮內(nèi)酯或雷公藤多苷單獨使用,但作用不明顯。

表1 穿心蓮內(nèi)酯與雷公藤多苷對小鼠耳腫脹率的影響(n=6)

注:同列不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著。下同。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷對小鼠醋酸扭體試驗的影響

如表2所示,與相比,地塞米松組能顯著降低小鼠扭體次數(shù)(P<0.05),雷公藤多苷組與穿心蓮內(nèi)酯單獨應用及配伍使用均可極顯著地降低小鼠扭體次數(shù)(P<0.01);與雷公藤多苷組、穿心蓮內(nèi)酯組相比,配伍組雖降低小鼠扭體次數(shù),但無顯著性差異。

表2 穿心蓮內(nèi)酯與雷公藤多苷對小鼠扭體次數(shù)的影響(n=6)

2.3 穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷對小鼠痛閾值的影響

如表3所示,與模型組相比,地塞米松組、雷公藤多苷組、穿心蓮內(nèi)酯組,雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯配伍組均能延長小鼠熱板反應的痛閾值;與雷公藤多苷組、穿心蓮內(nèi)酯組相比配伍組能延長小鼠熱板反應的痛閾值,具有鎮(zhèn)痛效果。

表3 穿心蓮內(nèi)酯與雷公藤多苷對小鼠痛閾值的影響(n=6)

2.4 穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷對LPS誘導小鼠血清生理生化指標的影響

如表4所示,與空白組相比,經(jīng)LPS誘導后的炎癥小鼠,血液中白細胞含量顯著升高(P<0.05),中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞含量極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷單獨應用或配伍組均能極顯著降低白細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的含量(P<0.01);雷公藤多苷組或穿心蓮內(nèi)酯組與配伍組相比無顯著性差異。

如表5所示,與空白組相比,經(jīng)LPS刺激后小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶含量顯著升高(P<0.05),谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐含量極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷單獨應用或配伍組均能顯著降低小鼠血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶活力、尿素氮、肌酐的含量(P<0.05),極顯著降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量(P<0.01);雷公藤多苷組或穿心蓮內(nèi)酯組與配伍組相比無顯著性差異。因此,與穿心蓮內(nèi)酯配伍不能減弱雷公藤多苷的毒性。

表4 穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷對LPS誘導的炎癥小鼠血液生理指標的影響(n=6)

表5 穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷對LPS誘導的炎癥小鼠血液生化指標的影響(n=6)

3 結(jié)論與討論

炎癥的局部癥狀多是由于局部血管充血、炎性水腫、細胞變性、壞死等所導致的紅、腫、熱、痛、機能障礙。較嚴重時則引起全身反應,造成實質(zhì)器官的損傷,在由細菌感染而引起的急性炎癥中,血液中白細胞數(shù)量明顯升高[8]。在本研究中LPS誘導小鼠全身炎癥反應的血常規(guī)檢測結(jié)果顯示,未給藥的小鼠經(jīng)腹腔注射LPS致炎后,血液中各類白細胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01),不論是穿心蓮內(nèi)酯或雷公藤多苷單獨給藥,還是配伍使用,都能顯著或極顯著地降低血液中各類白細胞的數(shù)量,說明雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯配伍使用和單獨使用同樣能起到較強的全身抗炎作用。

另外,本研究通過耳腫脹試驗、扭體試驗、熱板反應對小鼠模擬局部急性炎癥反應,結(jié)果表明,雷公藤多苷或穿心蓮內(nèi)酯單獨使用可顯著抑制小鼠因二甲苯所致的耳腫脹率(P<0.05)。而雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯配伍使用時,可極顯著地抑制小鼠因二甲苯所致的耳腫脹率(P<0.01)。可見雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯配伍使用可極顯著地緩解小鼠因炎癥所致的紅、腫、熱、痛,抗炎效果較雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯單獨使用好。

肌酐(CRE)是人體對肌肉的代謝產(chǎn)物,其代謝排除主要依靠腎小球的濾過作用,其含量可反應腎小球的濾過功能,當腎臟受到損傷時,血液中肌酐的含量會顯著提高[9];尿素氮(BUN)也通過腎小球濾過排出體外,當腎臟病變或受損時,血液中的尿素氮含量也會因代謝異常而提高[10]。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要存在與肝細胞中,當肝臟受到損傷時,AST和ALT會釋放到血液中,使其在血液中的含量升高[11]。本試驗通過LPS誘導的小鼠全身炎癥反應試驗,檢測出雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯配伍使用可以顯著減少小鼠血液中因炎癥而升高的肌酐、尿素氮、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量,但與雷公藤多苷或穿心蓮內(nèi)酯單獨使用的結(jié)果沒有顯著性差異,表明穿心蓮內(nèi)酯和雷公藤多苷配伍不能減弱雷公藤的毒性。

研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷和穿心蓮內(nèi)酯配伍使用與單獨使用都具有較強的抗炎效果,且兩者配伍使用效果更好,但兩者單獨使用和配伍使用的抗炎效果不具有顯著性差異,無統(tǒng)計學意義。其次,與穿心蓮內(nèi)酯配伍后,雷公藤多苷的毒性并未減弱。因此,治療炎癥反應時,單獨使用穿心蓮內(nèi)酯或雷公藤多苷即可。