來景輝, 胡青海

(1.宿州職業(yè)技術學院，安徽 宿州 234101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer，RA)引起家鴨、鵝、火雞及其他鳥類感染的一種高度接觸性、高致死性傳染病，感染動物常呈急性或慢性敗血癥。自然條件下家鴨最易感染，年齡越小，發(fā)病率和死亡率越高[1-2]。臨床上常表現(xiàn)為精神沉郁、不食、離群呆立等，并伴有肝周炎、纖維素性心包炎和氣囊炎等病理變化；部分出現(xiàn)腦膜炎、干酪性輸卵管炎、結膜炎、關節(jié)炎等病理變化；死亡率可高達75%，病鴨由于生長緩慢，通常會變成殘次鴨或者僵鴨。臨床上鴨疫里默氏桿菌可以形成生物被膜。細菌生物被膜(Bacteria Biofilm，BBF)是其在生長的過程中為了適應外界的環(huán)境而形成的細菌菌體聚集的生存方式，一般情況下是膜狀結構，這一層的細菌膜結構可以黏附于物質的表面，也可以包裹在自身胞外多糖基質當中[3]。對于自然界中的細菌而言生物被膜對于抗生素的耐受以及免疫逃避等方面發(fā)揮著至關重要的作用，進而導致了細菌對宿主的持續(xù)感染或者慢性感染[4-5]。RA產(chǎn)生生物被膜與該病在養(yǎng)鴨場持續(xù)性感染有關還有待于繼續(xù)研究。本研究用結晶紫法檢測21株RA形成生物被膜的比例以及形成能力，并研究兩種常用抗生素在RA生物被膜形成過程中的作用，從而為臨床上提供防治該病的提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

結晶紫(購于生工生物工程有限公司)；TSB培養(yǎng)基(NaCl 5.0 g，胰蛋白胨17.0 g，K2HPO42.5 g，大豆胨3.0 g，Glucose 2.5 g)，無水乙醇均購于國藥試劑公司。E.coli DH5a購于Invitrogen公司。RA CH3株來自上海獸醫(yī)研究所。頭孢哌酮、四環(huán)素均購于生工生物工程有限公司。TSA培養(yǎng)基制備:在1 000 mL TSB液體培養(yǎng)基中加入瓊粉15 g，高壓滅菌，無菌倒皿后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。試驗用水?jīng)121 ℃下滅菌15 min。

1.2 測定項目及分析方法

1.2.1 生物膜形成的檢測 結晶紫法測定生物膜形成。將實驗室分離的21株RA和E.coli DH5a轉接種到TSB培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃搖床150 rpm震蕩培養(yǎng)16 h。

用TSB液將培養(yǎng)菌液稀釋到最佳濃度OD655約為0.1 ug/mL，并將稀釋的溶液加入96孔平板中，每孔200 μL，放置在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中24 h。靜置培養(yǎng)后棄去上清液，用200 μL 0.01 mol/L PBS輕輕洗滌每孔3次，自然干燥后向每個孔加入200 μL 0.1%結晶紫，在室溫下作用30 min后棄除結晶紫，用超純水洗滌4次并自然晾干；向每孔加入100 μL 95%無水乙醇使剩余結晶紫充分溶解，并測量其在595 nm時的吸光度，E.coli DH5a作為陰性對照。標準：當測定的RA菌株生物被膜的OD595≥0.31時，作為菌株能形成生物被膜的濃度，約為陰性對照值的2倍左右；根據(jù)生物膜形成的強度，將這些菌株人為分為3類:生物被膜形成能力強株(OD595≥1)，生物被膜形成能力弱株(0.31

1.2.2 生物膜對抗生素作用的影響測定 取CH3 24 h培養(yǎng)液，用TSB液稀釋至最佳濃度OD655為0.1 μg/mL，并將稀釋的溶液加入96孔平板中，每孔200 μL，分別加入不同濃度(0.024～1 000 μg/mL)的四環(huán)素、頭孢哌酮，放于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將生物被膜吹散后分光光度計測OD655值。

判定標準：可抑制細菌出現(xiàn)的最低藥物濃度作為最小抑菌濃度；每孔10 μL菌液中經(jīng)培養(yǎng)沒有可見細菌生長的濃度，而且在TSA培養(yǎng)基平板上經(jīng)24 h培養(yǎng)沒有細菌生長的藥物濃度作為最小殺菌濃度。

2 結果與分析

2.1 不同菌株生物被膜檢測

采用結晶紫染色法檢測21株鴨疫里默氏桿菌菌株生物膜形成，發(fā)現(xiàn)在96孔平底聚乙烯板中培養(yǎng)檢測的21株鴨疫里默氏桿菌中，有11株鴨疫里默氏桿菌能形成生物被膜，約占比為52.38%(11/21)；在這11株能形成生物被膜的鴨疫里默氏桿菌中，有6株OD595≥1，屬于強形成株；有5株0.31

圖1 用結晶紫染色法檢測鴨疫里默氏桿菌生物被膜的形成

2.2 生物被膜對抗生素作用的影響

通過檢測MIC和MBC來比較頭孢哌酮、四環(huán)素對有無生物被膜形成狀態(tài)下的CH3的影響。結果發(fā)現(xiàn)，不論是MIC還是MBC，生物膜狀態(tài)的藥物濃度都遠遠高于浮游狀態(tài)下的濃度，約為4～27倍；說明生物被膜具有保護菌體免受抗生素損害的能力。另一方面，兩種狀態(tài)下頭孢哌酮的有效濃度遠低于四環(huán)素的用藥濃度，說明試驗鴨疫里默氏桿菌菌株對頭孢哌酮高度敏感。臨床上注射頭孢哌酮的治療效果要好于四環(huán)素。

表1 頭孢哌酮、四環(huán)素對CH3 的懸浮狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)的MIC和MBC

3 結論與討論

目前,國內大部分養(yǎng)鴨集中地區(qū)的鴨場都被此病所困擾，一個鴨場的鴨群一旦被鴨疫里默氏桿菌感染后就很難從這個鴨場根除此病，從而影響?zhàn)B殖效益，所以一些養(yǎng)鴨專業(yè)戶常采取的措施是過幾年就轉移到另外一個場地建立新的鴨場，大大增加了養(yǎng)鴨的成本。使用安全、有效的菌苗是預防本病的一項重要措施。但是，越來越多的血清型在我國出現(xiàn)，增加了防治鴨疫里氏桿菌感染的難度，所以當務之急必須對當?shù)豏A血清型作好監(jiān)測工作，同時還需進一步完善免疫學的快速診斷方法，加強鴨疫里氏桿菌病病理學、免疫學、血液學及其發(fā)病機理和免疫機能等方面研究，以明確臨床病理特征，為臨床診治和免疫預防提供科學依據(jù)。

推測生物被膜可能是環(huán)境中鴨疫里默氏桿菌重要的儲存庫，使鴨疫里默氏桿菌病在同一個鴨場可反復發(fā)生和流行，難以清除的原因。試驗檢測的21株鴨疫里默氏桿菌中，52.38%(11/21)的菌株能形成生物被膜，與胡青海等研究的41.86%的RA能形成生物被膜的結果相似。有研究表明因為生物被膜的存在，在臨床上可有效保護菌體免受抗菌藥物的損害，增加臨床治療本病的難度。本試驗的研究發(fā)現(xiàn)形成生物被膜的CH3 比其沒有形成生物膜狀態(tài)對頭孢哌酮、四環(huán)素更加耐受，與相關報道相符。這種耐受現(xiàn)象表明RA菌株可能在一些鴨場形成生物被膜從而導致該病在鴨場持續(xù)性感染，在適當?shù)臈l件下，這些存活的細菌就能引起新一輪感染。

粘附、發(fā)展和成熟是生物被膜的形成過程的3個階段[6-7]，生物膜形成過程涉及一系列基因信號轉導通路的開啟或關閉[8-9]。探討分析鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成的分子機制，生物被膜的形成與病菌持續(xù)性存在相關性作為研究重點。因此研究參與生物被膜形成的相關基因，為抗細菌性感染特別是難治性感染提供了嶄新的途徑。在此基礎上，研究分析生物被膜形成相關基因在形成強、弱和不形成生物被膜的鴨疫里默氏桿菌菌株中的分布，以篩選鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成過程中的關鍵基因，為研究鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成的分子機制，以及篩選抑制鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成的靶標等奠定基礎。有研究表明[10]：鴨疫里默氏桿菌菌株均攜帶asrpdp、dhdps、ftsq和hthdp基因是與鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成相關的保守基因，將可能是潛在的藥物靶標，既可以抑制或破壞鴨疫里默氏桿菌生物被膜的形成，又可能抑制或殺滅所有的鴨疫里默氏桿菌，為鴨疫里默氏桿菌的防控提供新的思路。