劉偉 馮晶 夏平 浦飛飛 王志偉 汪朋 黃覓 趙曉龍

武漢市第一醫(yī)院骨科（武漢430030）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）及其繼發(fā)的病理改變是引起下腰痛（low back pain，LBP）的最主要原因，是脊柱失穩(wěn)、頸椎病、腰椎管狹窄等一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)［1］。近年來，提取自天然植物的化合物已用于治療退行性疾病，療效較好且副作用較少［2-3］。黃芩素是從黃芩干根中提取的一種黃酮類化合物，在中國和其他一些國家被廣泛使用。黃芩素具有抗氧化、抗病毒、抗血栓、抗心血管疾病、體內(nèi)外抗腫瘤等作用。黃芩素因其可抑制軟骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)而延緩骨性關(guān)節(jié)炎退變的作用，在骨性關(guān)節(jié)炎防治中被廣泛研究［4］，然而，迄今為止，黃芩素能否延緩椎間盤退變，以及延緩椎間盤退變的機(jī)制鮮有報道。本研究利用壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變模型，探討黃芩素是否抑制髓核細(xì)胞的凋亡，為黃芩素抗椎間盤退變的作用機(jī)制研究提供線索，并且能為中藥研發(fā)提供新思路以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 正常椎間盤標(biāo)本的獲取選取自2018年1月至2019年1月在武漢市第一醫(yī)院行脊柱側(cè)彎矯形術(shù)的患者。手術(shù)收集了4 例來自特發(fā)性脊柱側(cè)彎患者的正常髓核標(biāo)本（平均年齡15.5 歲，范圍10 ～21 歲）。取材節(jié)段為L4∕L5或者L5～S1，所有標(biāo)本均在髓核離體30 min 內(nèi)獲取。術(shù)前所有患者根據(jù)Pfirrmann 分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行退變程度的分級，4 例髓核標(biāo)本均為Ⅱ級，為正常髓核標(biāo)本。本研究經(jīng)武漢市第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或其父母均簽署知情同意書。

1.2 藥品與試劑黃芩素（純度≥98%）購自阿拉丁工業(yè)公司（美國）。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色劑及CCK8 細(xì)胞活力檢測試劑盒購自Beyotime（中國上海）。兔多克隆抗體Bax，兔多克隆抗體Bcl-2，兔單克隆抗體cleaved-caspase 3，兔單克隆抗體cytochrome C、兔單克隆抗體ERK-1∕2、兔單克隆抗體p-ERK-1∕2 及兔多克隆抗體GAPDH一抗和山羊抗兔的二抗均購自Abcam（Cambridge，UK）。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司（上海，中國）。二甲基亞砜（DMSO）和膠原酶Ⅱ購自Sigma（St.Louis，MO，USA）。細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco（Grand Island，NY，USA）。

1.3 髓核細(xì)胞分離與培養(yǎng)將新鮮髓核組織剪成小碎塊，用0.1% Ⅱ型膠原酶消化6 ～8 h，離心后收集沉淀，以含20% 胎牛血清的DMEM∕F12 培養(yǎng)，置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中，7 d 后首次更換培養(yǎng)液，以后每周更換培養(yǎng)液2 次。在倒置相差顯微鏡下觀察原代髓核細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞融合90%后傳代。P= 1 代的髓核細(xì)胞用來后續(xù)體外實驗研究。

1.4 髓核細(xì)胞處理（1）不同濃度黃芩素（0、5、25、50、75、100 μmol∕L）處理正常髓核細(xì)胞，24 h 后測髓核細(xì)胞的活力，選取最佳處理濃度；（2）本實驗分為3 組：正常組（A 組），取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的正常人髓核細(xì)胞，以每孔5 × 105個接種于細(xì)胞培養(yǎng)6 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；不用（B 組）和用50 μmol∕L 黃芩素預(yù)處理24 h后，置于1 Mpa壓力培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（C組）。24 h后進(jìn)行實時熒光定量PCR、Western Blot、Tunel 等一系列檢測。

1.5 CCK8取生長狀態(tài)良好的壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整5 × 104∕mL，接入96 孔板，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，同時設(shè)空白組（在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞貼壁后，不同濃度黃芩素處理髓核細(xì)胞（0、5、25、50、75、100 μmol∕L），每組3 個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD450。

1.6 實時熒光定量PCR（Realtime PCR）根據(jù)使用說明書，使用Trizol 試劑（Invitrogen）從髓核細(xì)胞中提取總RNA。采用分光光度法測定RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)盒使用說明書，用PrimeScriptTMRT Master Mix（TakaRa，Dalian，China）逆轉(zhuǎn)錄RNA。以GAPDH 為內(nèi)參，實時PCR 定量分析各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3 和cytochrome C 的表達(dá)量。每個樣品設(shè)置3 個副孔，采用2-△△Ct法計算基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.7 Western Blot 檢測收集各組細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用半干法將蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡硝酸纖維素膜，室溫?fù)u床封閉2 h。加入一抗Bax（1∶5 000 稀釋），Bcl-2（1∶2 000稀釋），cleaved-caspase 3（1∶1 000 稀釋）、cytochrome C（1∶10 000 稀釋）、ERK（1∶1 000 稀釋）、p-ERK（1∶2 000 稀釋）和GAPDH（1∶500 稀釋），4 ℃過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h，暗室曝光，觀察結(jié)果，用BandScan 分析膠片灰度值。

1.8 Tunel收集各組髓核細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定1 h 后，用0.1%Triton X-100 培養(yǎng)10 min，用PBS 洗滌3 次。按照使用說明書，用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（F.Hoffmann La Roche Ltd.，瑞士巴塞爾）和40，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）對細(xì)胞進(jìn)行染色。吸水紙擦干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。本實驗使用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組實驗重復(fù)3 次。采用單因素方差分析和兩兩比較分析方法。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素增強(qiáng)髓核細(xì)胞的活力筆者應(yīng)用不同濃度的黃芩素處理正常髓核細(xì)胞，24 h 后CCK8 檢測髓核細(xì)胞的活力。結(jié)果表明黃芩素濃度為0 ～50 μmol∕L 時，隨著濃度的增加，髓核細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)。50 μmol∕L 時，髓核細(xì)胞活力最強(qiáng)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。50 μmol∕L以后，隨著黃芩素濃度的增加，髓核細(xì)胞的活力逐漸減弱。因此，黃芩素可以增強(qiáng)髓核細(xì)胞的活力，并且具有濃度依賴性，其中濃度為50 μmol∕L 時黃芩素的作用最強(qiáng)（圖1）。

圖1 黃芩素細(xì)胞活力和濃度依賴性Fig.1 Baicalein nucleus pulpocyte viability and concentration dependent

2.2 黃芩素抑制促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯收集正常對照組、壓力組及壓力+黃芩素組等3 組細(xì)胞的RNA 和蛋白，進(jìn)行RT-PCR 和WB 檢測。結(jié)果表明，壓力刺激增加Bax、cleaved-caspase 3 、cytochrome C 等促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。然而黃芩素處理后，促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯減弱（P ＜0.05，圖2）。

2.3 黃芩素促進(jìn)Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄和翻譯對上述3組細(xì)胞的RNA 和蛋白進(jìn)行檢測。RT-PCR 結(jié)果表明，壓力刺激減少Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄，與壓力組比較，黃芩素組的Bcl-2 轉(zhuǎn)錄明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。WB 結(jié)果表明，壓力刺激明顯減少Bcl-2 的表達(dá)，與壓力組比較，黃芩素明顯增加Bcl-2 的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05，圖3）。

圖2 Bax，cleaved-caspase 3 和cytochrome C 的表達(dá)Fig.2 The expression of Bax，cleaved-caspase 3 and cytochrome C

圖3 Bcl-2 的表達(dá)Fig.3 The expression of Bcl-2

2.4 黃芩素抑制壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞的凋亡50 μmol∕L 的黃芩素處理髓核細(xì)胞，1 MPa 壓力刺激髓核細(xì)胞，24 h 后收集3 組細(xì)胞，采用Tunel 方法測髓核細(xì)胞的凋亡。Tunel 結(jié)果表明，壓力刺激明顯增加髓核細(xì)胞的凋亡。然而，黃芩素處理后，壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡明顯減少（圖4）。

圖4 髓核細(xì)胞的凋亡Fig.4 Apoptosis of nucleus pulposus cells

2.5 黃芩素抑制MEK/ERK 信號通路的激活MEK∕ERK 信號通路在椎間盤退變進(jìn)程中起重要作用，筆者收集上述3 組細(xì)胞的蛋白，檢測MEK∕ERK 信號通路的活性。結(jié)果表明，壓力促進(jìn)ERK的磷酸化，然而黃芩素處理后ERK 磷酸化的程度明顯減弱（圖5）。

3 討論

椎間盤退變的危險因素主要包括過度壓力、基因易感性、營養(yǎng)缺乏、糖尿病、細(xì)胞外基質(zhì)含量及種類的改變、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)增多及促炎癥因子的過表達(dá)等［5］。在以上眾多致病因素中，過度壓力在椎間盤退變中的作用尤為突出。有證據(jù)表明椎間盤的生理壓力從0.1 ～0.9 MPa。適度壓力對椎間盤具有保護(hù)作用，然而過度的壓力刺激可加劇椎間盤退變進(jìn)程［6］。髓核細(xì)胞作為椎間盤組織中的重要成員，是椎間盤組織形成和維持組織代謝和結(jié)構(gòu)的重要效應(yīng)細(xì)胞。前期研究表明，髓核細(xì)胞在受到壓力、缺氧等各種退變因素刺激后，自身大量炎癥介質(zhì)表達(dá)增加，并被迅速分泌到髓核組織中，通過增加髓核細(xì)胞凋亡，引起椎間盤退變［7-8］。研究結(jié)果證實控制髓核細(xì)胞中壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡可有效緩解椎間盤退變。因此，試圖延緩過度壓力對髓核細(xì)胞的作用在椎間盤退變的研究中具有重要意義。

圖5 MAPK∕ERK 信號通路的激活Fig.5 Stimulation of MAPK∕ERK signaling pathway

黃芩素是從植物黃芩中提取的黃酮類化合物。有研究［9］報道，黃芩素具有抗炎、抗菌、抗氧化等生物學(xué)功效。黃芩素可通過抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而達(dá)到治療疾病的目的。近年研究表明，黃芩素處理可以增加Bcl-2 的表達(dá)及導(dǎo)致caspase 活化的阻斷［10］。在骨性關(guān)節(jié)炎中，LI 等［11］發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠減弱IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及抑制軟骨細(xì)胞凋亡，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的退變。另外，脊髓損傷后，黃芩素可以通過激活自噬，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，壓力刺激能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，黃芩素能夠逆轉(zhuǎn)過度壓力對髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。

MAPK 信號通路在椎間盤退變中發(fā)揮重要作用。ERK 屬于MAPK 激酶家族，其轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞外刺激進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)，參與髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成分解代謝及細(xì)胞凋亡進(jìn)程［13］。TNF-α與受體結(jié)合后可激活MAPK∕ERK 信號通路，通過增加促凋亡蛋白Bax 及減少抑制凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡［14］。然而，抑制MAPK∕ERK 信號通路的激活，可以明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞外基質(zhì)退變及髓核細(xì)胞凋亡，從而延緩椎間盤退變進(jìn)程［15］。本研究中，壓力刺激明顯增加ERK-1∕2 的磷酸化，黃芩素處理后ERK-1∕2 的磷酸化程度明顯減弱，所以筆者認(rèn)為黃芩素通過抑制MAPK∕ERK 信號通路的激活延緩壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡。

本研究只是初步探討了黃芩素對MAPK 信號通路的影響，未進(jìn)行靶向干預(yù)研究。后續(xù)實驗可靶向調(diào)控MAPK 信號通路，觀察黃芩素對壓力誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡的影響。