周會(huì)明，張焱珍，柴紅梅，楊榮情，譚 瑩，張萍萍，白玉英，趙一蓮，金玉潔

(1.滇西科技師范學(xué)院 生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨3 g、KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然。

碳氮比(C/N)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、瓊脂15 g、水1 L、pH自然。

1.2 方法

1.2.1 子實(shí)體的采集、分離純化與培養(yǎng)

在云南省臨滄市芒角社區(qū)綠化帶的草坪采集到一株野生幼嫩子實(shí)體，依據(jù)其宏觀與微觀形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定；在PDA培養(yǎng)基上，采用菌肉組織分離法，經(jīng)25 ℃下遮光培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)物，編號(hào)為L(zhǎng)CT10。

1.2.2 ITS序列分析

菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)10 d，采用CTAB法[11]提取野生菌株LCT10菌絲體DNA，用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)擴(kuò)增ITS片段[12]。PCR產(chǎn)物在昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的ITS序列通過(guò)NCBI在線BLASTN檢索，與GenBank中的ITS基因序列進(jìn)行同源性比較，然后利用ClustalX軟件對(duì)所得序列進(jìn)行多序列聯(lián)配分析，并使用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，計(jì)算遺傳距離[13]。

1.2.3 菌絲體的活化

1.2.4 溫度試驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基平板中央接入直徑為5 mm的菌塊，在溫度梯度5、10、15、20、25、30 ℃分別連續(xù)恒溫黑暗培養(yǎng)22 d，每溫度處理3次重復(fù)。采用多次十字交叉法測(cè)定菌落直徑，依據(jù)生長(zhǎng)時(shí)間(d)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度(mm·d-1)，根據(jù)菌絲濃密程度記錄生長(zhǎng)勢(shì)[15]。

1.2.5 pH試驗(yàn)

用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH至4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH的平板中央接入直徑5 mm的菌塊餅各1塊，3個(gè)重復(fù)，在(25±3)℃黑暗培養(yǎng)20 d。菌落直徑、菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定方法同1.2.4節(jié)。

1.2.6 光照試驗(yàn)

1.2.7 通氣性試驗(yàn)

接種后于25 ℃恒溫黑暗連續(xù)培養(yǎng)20 d，培養(yǎng)期間共分成處理1(不處理)、處理2(每隔10 d在酒精燈火焰下通風(fēng)5 s)、處理3(每隔5 d在酒精燈火焰下通風(fēng)5 s)及處理4(每隔1 d在酒精燈火焰下通風(fēng)5 s)4組處理，每處理3個(gè)重復(fù)。菌落直徑、菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定方法同1.2.4節(jié)。

1.2.8 碳氮源試驗(yàn)

在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，分別用2%的蜂蜜、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖代替葡萄糖做碳源試驗(yàn)；同樣的方法，分別用0.3%的尿素、甘氨酸、硝酸銨代替蛋白胨做氮源試驗(yàn)。菌落直徑、菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定方法同1.2.4節(jié)。

1.2.9 C/N試驗(yàn)

在C/N基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，以葡萄糖為碳源，甘氨酸為氮源，配制C/N分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1的6種培養(yǎng)基。菌落直徑、菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定方法同1.2.4節(jié)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株LCT10子實(shí)體形態(tài)特征

2.2 基于ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 溫度對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 pH對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 光照對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

圖1 野生黃雞子實(shí)體

圖2 基于ITS序列的黃雞與其他雞菌屬種的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育分析(1 000次重復(fù))

數(shù)據(jù)為菌絲生長(zhǎng)速度的3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。柱上無(wú)相同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，柱上無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。菌絲生長(zhǎng)勢(shì)：+++表示濃密，++表示較濃密，+表示稀疏；-表示不生長(zhǎng)。下同。Values represent of 3 replicates of mycelial growth rate. Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. “+++”indicated that mycelia grew vigorously， “++”indicated that mycelia grew ordinarily， “+” indicated that mycelia grew weakly， “-”indicated that mycelia didn’t grow. The same as below.

2.6 通氣性對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

2.7 碳源對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

2.8 氮源對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

2.9 碳氮比(C/N)對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

圖4 pH對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

圖5 光照強(qiáng)度對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)影響的比較

3 結(jié)論與討論

圖6 通氣性對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)的影響

圖7 碳源對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)影響的比較

圖8 氮源對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)影響的比較

圖9 碳氮比對(duì)黃雞菌絲生長(zhǎng)影響的比較