李倩，衛(wèi)陽(yáng)飛，黃瑞萍，安瓊,*

(1.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn),甘肅 張掖 734000)

鎖陽(yáng),俗稱“不老藥”,又名繡鐵棒、地毛球、沙漠人參等,為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)CynomoriumsongaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖。鎖陽(yáng)有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便的功效,用于腎陽(yáng)不足,精血虧虛,腰膝酸軟,陽(yáng)痿滑精,腸燥便秘等[1]。鎖陽(yáng)廣泛分布于甘肅、新疆、內(nèi)蒙、寧夏、青海等地,其中質(zhì)量最好的是甘肅河西地區(qū)瓜州的鎖陽(yáng),有“瓜州鎖陽(yáng)甲天下”的美譽(yù),特別是鎖陽(yáng)城“三九鎖陽(yáng)”，更是鎖陽(yáng)中的極品,被當(dāng)?shù)厝艘暈檎鋵?人稱“三九鎖陽(yáng)賽人參”[2-4]。

據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道,對(duì)鎖陽(yáng)藥材的研究，主要探討了化學(xué)成分[5]、提取工藝[6-7]、藥理活性[8-9],用特征指紋圖譜系統(tǒng)控制鎖陽(yáng)藥材質(zhì)量研究較少，除了劉曄瑋等，建立鎖陽(yáng)藥材不同產(chǎn)區(qū)高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)指紋圖譜，針對(duì)甘肅河西道地藥材鎖陽(yáng)特征指紋圖譜的研究尚未見(jiàn)到報(bào)道。

鎖陽(yáng)藥材中含有鞣酸、黃酮、三萜、酸性多糖、甾體、木脂素和生物堿等多種成分。常艷旭等研究者認(rèn)為兒茶素可作為鎖陽(yáng)活性成分黃酮類的代表，熊果酸可作為活性成分三萜類的代表[10-11]。對(duì)其指標(biāo)性成分的含量測(cè)定，紫外檢測(cè)器的方法較多[12]。但熊果酸結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛結(jié)構(gòu)和強(qiáng)的生色團(tuán)，用紫外檢測(cè)器測(cè)定末端吸收干擾較大[13]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種通用型檢測(cè)器，它可以對(duì)末端吸收弱、沒(méi)有生色團(tuán)的物質(zhì)均產(chǎn)生響應(yīng)。對(duì)于中藥材，根據(jù)指標(biāo)成分的特點(diǎn)構(gòu)建與之相適應(yīng)的分析方法，可有效表征鎖陽(yáng)藥材化學(xué)成分,對(duì)其評(píng)價(jià)其質(zhì)量和真?zhèn)尉哂兄匾饬x。

本文根據(jù)熊果酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，探索了用HPLC-ELSD法測(cè)定鎖陽(yáng)藥材三萜類代表的指標(biāo)性成分熊果酸，分析了不同產(chǎn)地不同批次甘肅河西道地鎖陽(yáng)藥材，建立了甘肅河西道地鎖陽(yáng)藥材HPLC-ELSD特征指紋圖譜并對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)聚類分析，對(duì)不同批次鎖陽(yáng)藥材的起源進(jìn)行了識(shí)別，為甘肅河西道地鎖陽(yáng)藥材質(zhì)量控制提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

1.1.1 藥材

鎖陽(yáng)藥材，購(gòu)自當(dāng)?shù)氐乃幍?。獲得的藥材由河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院宋玉霞老師鑒定為為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)CynomoriumsongaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖(樣品信息見(jiàn)表1)。

表1 樣品信息表

1.1.2 試劑

熊果酸對(duì)照品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物科技有限公司(批號(hào)分別為：1511127 純度≥98.0%),乙腈(色譜純，山東禹王試劑廠)，甲醇(色譜純，山東禹王試劑廠)，乙醇(分析純，安徽安特生物化學(xué)有限公司出品)，冰醋酸(分析純，上海玻爾化學(xué)試劑有限公司)，三氟乙酸(南京國(guó)晨化工)，水為重蒸水。

1.2 儀器和色譜條件

1.2.1 儀器

高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣閥。KH-3000DB數(shù)控型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。十萬(wàn)分之一天平(上海奧豪斯Discovery專業(yè)性分析天平)，用于標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的稱量。小型中藥粉碎機(jī)(久品旗艦店)，粉碎鎖陽(yáng)藥材。

1.2.2 色譜條件

Inertsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)為固定相,流動(dòng)相組成：A為乙腈，B為0.1%的三氟乙酸水溶液；線性梯度洗脫程序見(jiàn)表2，每次進(jìn)樣之前用初始梯度濃度平衡約10 min。柱溫室溫，流速0.8 mL·min-1，漂移管75℃，氣體流速2.0 L·min-1。

表2 梯度洗脫程序(%)

1.3 溶液制備

對(duì)照品制備：稱取熊果酸的對(duì)照品適量用流動(dòng)相溶解，置成約2.0 mg·mL-1的溶液,用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，備用。

供試品制備：取10批鎖陽(yáng)藥材的樣品各自粉碎，過(guò)80目篩，稱取約1.0 g，精密稱定。置于100 mL錐形瓶，量取70%乙醇10 mL，在溫度60℃，超聲頻率100 Hz，超聲30 min，濾過(guò)，濾液濃縮后加入約10 mL流動(dòng)相, 用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的中藥色譜特征指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)，生成對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算相似度；用SPSS(22.0)軟件做聚類分析；用Origin6.0軟件做圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 優(yōu)化提取條件

鎖陽(yáng)樣品，用超聲波法提取。首先考察不同類型的提取溶劑(水、甲醇、乙醇和乙醚等)對(duì)其活性成分提取的影響。然后系統(tǒng)考察不同溫度，不同溶劑，不同溶劑比例，提取次數(shù)對(duì)起提取的影響，實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用極差分析作為結(jié)果的評(píng)價(jià)，選出最佳鎖陽(yáng)藥材活性成分的提取方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫度在60℃，用70%乙醇做溶劑，溶劑量10 mL，提取一次，提取的鎖陽(yáng)樣品色譜峰的出峰個(gè)數(shù)較多。

2.2 優(yōu)化HPLC-ELSD的色譜條件

2.2.1 流動(dòng)相組成

先用等度洗脫程序，甲醇-水，甲醇-水(0.05%三氟乙酸)，甲醇-水(0.10%三氟乙酸)，甲醇-水(0.12%三氟乙酸)，乙腈-水(0.05%三氟乙酸)，乙腈-水(0.10%三氟乙酸)，乙腈-水(0.12%三氟乙酸)分別作為流動(dòng)相，以樣品的出峰數(shù)目、分離度、峰形作為考察指標(biāo)選擇流動(dòng)相的組成。結(jié)果顯示甲醇-水做為流動(dòng)相鎖陽(yáng)藥材的色譜峰的出峰個(gè)數(shù)較多、有較好的分離度，當(dāng)在水溶液中加入0.10%三氟乙酸，色譜峰比較對(duì)稱。于是甲醇-水(0.10%三氟乙酸)作為樣品分析的流動(dòng)相。然后選用梯度洗脫程序，優(yōu)化梯度洗脫程序，當(dāng)在1.2.2項(xiàng)下的梯度程序時(shí)，鎖陽(yáng)藥材的成分分離度較好，出峰較多。

2.2.2 流速

對(duì)于流速，雖然隨著流速的增加(0.6，0.7，0.8,0.9，1.0 mL·min-1)分析時(shí)間縮短。但是，流速大于1.0 mL·min-1時(shí)保留時(shí)間相近的色譜峰會(huì)被掩蓋；流速低于0.7 mL·min-1，分析時(shí)間延長(zhǎng)且色譜峰重疊的較多，出峰個(gè)數(shù)減少。因此實(shí)驗(yàn)選用0.8 mL·min-1流速作為最佳流速。

2.2.3 漂移管的溫度

對(duì)于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管的溫度是一項(xiàng)重要的影響參數(shù)。當(dāng)漂移管的溫度低時(shí)，溶劑發(fā)揮不完全；漂移管的溫度高時(shí)，因分析樣品中含有揮發(fā)性的成分，檢測(cè)器的響應(yīng)會(huì)下降[14]。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，我們考察了漂移管的溫度在(65、70、75、80、85℃)對(duì)樣品出峰數(shù)的影響，當(dāng)溫度低于75℃時(shí)，溶劑發(fā)揮不完全，溫度高于75℃時(shí)，因鎖陽(yáng)藥材樣品中含有的揮發(fā)性成分，導(dǎo)致檢測(cè)器的響應(yīng)下降，結(jié)果二者均使出現(xiàn)在色譜圖上的色譜峰個(gè)數(shù)減少，于是我們選擇了75℃作為漂移管的最佳溫度。

2.2.4 氣體流速

霧化氣體的流速對(duì)樣品的出峰也有重要的影響，流速度太低時(shí)，會(huì)形成大量微滴，導(dǎo)致色譜峰出現(xiàn)尖峰信號(hào)或噪音信號(hào)；霧化氣流速度太高時(shí)，微滴會(huì)大量下降，導(dǎo)致信號(hào)響應(yīng)降低流速，我們考察了(1.8、2.0、 2.2 L·min-1)下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)霧化氣流速度低于2.0 L·min-1時(shí)，色譜圖上出現(xiàn)尖峰的信號(hào)；霧化氣流速度高于2.0 L·min-1時(shí)，出現(xiàn)在色譜圖上的色譜峰個(gè)數(shù)減少，于是我們選擇了2.0 mL·min-1作為氣體的流速。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系

取1.3項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相分別稀釋成約0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mg·mL-1的溶液，按1.2.2項(xiàng)下優(yōu)化的色譜條件，測(cè)定熊果酸峰面積，以對(duì)照品的濃度作為為橫坐標(biāo)(Y)，峰面積作為縱坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程為:Y=5.198 43X+3.978 83，r=0.999 8，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在優(yōu)化的色譜條件下熊果酸在濃度0.05～0.8 mg·mL-1的范圍內(nèi)線性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的溶液，在優(yōu)化的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄熊果酸色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD,RSD為0.95%，結(jié)果顯示該方法有好的精密度。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(批號(hào)1)，配制后的0、2、4、6、8、10、12 h分別在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄熊果酸色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD,RSD為1.08%，結(jié)果顯示鎖陽(yáng)藥材樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批鎖陽(yáng)藥材(批號(hào)1)5份，每份樣品取1 g，精密稱定。各自按供試品溶液制備方法處理，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄熊果酸峰色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD,RSD為1.01%，結(jié)果表明其重復(fù)性良好。

2.4 建立不同產(chǎn)地樣品HPLC-ELSD特征指紋圖譜

2.4.1 特征指紋圖譜的建立

特征指紋圖譜是一種包含中藥材中共有成分的色譜模式[15]，它反映了該藥材中起藥理活性的主要化學(xué)組分，體現(xiàn)了不同批次不同產(chǎn)區(qū)樣品之間的相似性。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中將樣品圖譜與特征指紋圖譜做對(duì)照，用相關(guān)系數(shù)的中位數(shù)作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)的中位數(shù)的值越大，說(shuō)明二者越相似，樣品可以鑒別為真品且該樣品的質(zhì)量較好。構(gòu)建特征指紋圖譜包括確定共有峰、計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間(RRA)和相對(duì)峰面積(RPA)。

將制備好的鎖陽(yáng)藥材的供試品溶液，在優(yōu)化的色譜條件分別進(jìn)樣分析，獲得10批樣品的色譜圖。然后將10批樣品色譜圖的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜特征指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，生成對(duì)照?qǐng)D譜，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，確定了12個(gè)共有峰做為鎖陽(yáng)藥材的共有峰。將熊果酸的對(duì)照品(圖1)與樣品比較，11號(hào)為熊果酸的色譜峰重現(xiàn)性良好，作為參照峰(S)。計(jì)算10批樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，作為鎖陽(yáng)藥材特征指紋圖譜的定量表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。RSD低于1.5%，結(jié)果顯示該法有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。建立的甘肅河西道地鎖陽(yáng)的特征指紋圖譜可以用于其藥材真?zhèn)蔚蔫b別和質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

2.4.2 相似度計(jì)算

將2.4.1生成的參照?qǐng)D譜圖2，與10批藥材的樣品色譜圖比較，計(jì)算相關(guān)系數(shù)的中位數(shù)，評(píng)價(jià)不同批次藥材之間的相似似度。甘肅民樂(lè)(S1-S3)、甘肅高臺(tái)(S4-S5)、甘肅瓜州(S6-S8)及甘肅甘州(S9-S10)的樣品相似度相關(guān)系數(shù)中位數(shù)分別為0.821 9,0.925 8,0.846 5,0.832 3,0.932 2,0.902 4,0.913 3,0.928 0，0.965 1,0.863 2。參照李丹毅的研究，相似度相關(guān)系數(shù)的中位數(shù)在0.9以上評(píng)價(jià)為優(yōu)質(zhì)藥材，0.8～0.9評(píng)價(jià)為質(zhì)量一般的藥材，低于0.8評(píng)價(jià)為偽劣藥材[16]。結(jié)果顯示：批號(hào)S2,S5,S6,S7,S8,S9為優(yōu)質(zhì)藥材，批號(hào)S1，S3，S4，S10質(zhì)量一般。10批樣品疊加的圖譜見(jiàn)圖3。

2.4.3 聚類分析

聚類分析是一種判別模式，中藥材通過(guò)該模式可以判別藥材起源的相近性[17]。將10批不同產(chǎn)地的鎖陽(yáng)藥材的共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，做聚類判別。結(jié)果如圖4，S6、S7、S8樣品在聚類圖上離的比較遠(yuǎn)；S1、S2、S3樣品在聚類圖近于S6-S8的藥材，S4、S5、S9、S10離的比較近。S6-S8是瓜州的藥材，在地理位置距離民樂(lè)、高臺(tái)、甘州比較遠(yuǎn)，其它的藥材來(lái)源屬于同一市區(qū)的，在距離上比較近。不同批次之間也有一定的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以區(qū)別不同產(chǎn)地不同批次的鎖陽(yáng)藥材。

表3 HPLC-ELSD色譜條件各批藥材共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 HPLC-ELSD色譜條件各批藥材共有峰的相對(duì)峰面積

圖1 HPLC-ELSD色譜條件下對(duì)照品色譜圖

圖2 HPLC-ELSD色譜條件下10批樣品的共有模式圖

圖3 HPLC-ELSD色譜條件下10批樣品色譜圖

圖4 聚類分析樹(shù)狀圖

3 結(jié)論

本研究根據(jù)鎖陽(yáng)藥材指標(biāo)性成分熊果酸無(wú)共軛結(jié)構(gòu)和強(qiáng)的生色團(tuán)，構(gòu)建了鎖陽(yáng)藥材的HPLC-ELSD特征指紋圖譜。對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)的考察，結(jié)果表明，建立的方法具有好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)合中藥相似度系統(tǒng)評(píng)價(jià)相似度和聚類分析模式判別的結(jié)果，建立的HPLC-ELSD特征指紋圖譜方法，可準(zhǔn)確的用于不同產(chǎn)區(qū)不同批次鎖陽(yáng)藥材質(zhì)量的鑒別和的產(chǎn)地的區(qū)分。