顧恒，李建香，劉云芳，過偉峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

腦出血在我國(guó)約占全部卒中的20%～30%，急性期病死率和致殘率高，存活患者也大多遺留后遺癥。受限于各地醫(yī)療水平，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為降低腦出血負(fù)擔(dān)的最佳方法仍以預(yù)防高血壓為主[1]。國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授在中風(fēng)痰熱腑實(shí)學(xué)說基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地提出瘀熱阻竅學(xué)說。認(rèn)為本病系火熱毒邪壅于血分，瘀熱搏結(jié)，氣火上沖，迫血上涌，灼傷腦絡(luò)；同時(shí)因腦中蓄血，郁而化熱，絡(luò)熱血瘀，進(jìn)一步損害腦元。據(jù)此，創(chuàng)制涼血通瘀方治療，功效涼血散瘀、通腑瀉熱。臨床觀察評(píng)價(jià)涼血通瘀方治療腦出血的臨床療效，經(jīng)168例觀察，總有效率88.0%，優(yōu)于對(duì)照組(169例)的77.5%(P<0.05)[2]。

腦出血后腦損傷主要在于原發(fā)性血腫引起的占位效應(yīng)以及繼發(fā)性病理改變。血腫周圍的缺血水腫區(qū)形成后，腦組織急性氧化應(yīng)激，生成的超氧陰離子自由基攻擊生物細(xì)胞膜大分子，同時(shí)引起一系列的炎癥反應(yīng)。而中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)后會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧，加重氧化損傷。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)貫穿本病各個(gè)階段，是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的關(guān)鍵機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)旨在從抗氧化和抗炎角度探討涼血通瘀方發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)的作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g，合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，5只/籠，自由飲水?dāng)z食，7:00～19:00光暗交替，恒溫恒濕。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

涼血通瘀方：生大黃10 g,水牛角30 g,生地黃20 g,赤芍15 g,牡丹皮10 g,石菖蒲10 g。中藥材按常規(guī)方法水煎煮濃縮，每毫升含生藥1.2 g。

Takara SYBR Premix Ex Taq(日本Takara公司)，Takara PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(日本Takara公司)，nNOS、TLR-4、IL-1β引物(上海生工生物工程有限公司)，MDA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

腦立體定位儀(成都泰盟軟件有限公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司)、注射泵控制器(保定蘭格恒流泵有限公司)、7500 Real Time PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

2 方法

2.1 腦出血模型的建立

大鼠稱體質(zhì)量編號(hào)，喂養(yǎng)一周后參照Xue M[3]自體尾動(dòng)脈血注入法，制備大鼠腦出血模型，造模后評(píng)估神經(jīng)功能缺損程度。選取Longa評(píng)分法中1～3分的大鼠作為模型動(dòng)物。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

大鼠隨機(jī)分為以下4組，每組18只，分配至用藥后1 、3 、5 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各時(shí)間點(diǎn)6只。

正常組、模型組、假手術(shù)組(開顱后插入進(jìn)樣器針頭但不注血)：予用藥組等體積生理鹽水。

涼血通瘀組：造模后3 h開始灌胃用藥，給藥量均為1 mL/100 mg體質(zhì)量，每日1次，共5 d。

2.3 行為學(xué)評(píng)分

采用Longa五級(jí)評(píng)分法[4]和平衡木測(cè)驗(yàn)[5]，于動(dòng)物蘇醒后評(píng)估神經(jīng)功能缺損癥狀。標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 腦出血大鼠行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)法檢測(cè)腦組織中MDA含量

取腦組織處理后按照MDA試劑盒說明書步驟操作，依次加樣孵育進(jìn)行顯色反應(yīng)，將96孔板置入酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腦組織MDA含量。

2.5 RT-PCR法檢測(cè)腦組織nNOS、CuZnSOD、TLR-4、IL-1β mRNA的表達(dá)

取體積約5×5×5 mm3大小的組織置于平頭管中，放入小鋼珠，按50～100 mg組織/mL Trizol加入Trizol使用球磨儀震蕩擊打裂解細(xì)胞，提取總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書配制反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物處理后于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)如下：nNOS(sense primer：AATGGTGGAGGTGCTGGAGGAG；anti-sense primer: CTGGAGAGGAGCTGATGGAGTAGTAG)；CuZnSOD(sense primer：GCCGTGTGCGTGCTGAAGG；anti-sense primer: TGTAATCTGTCCTGACACCACAACTG)；TLR-4(sense primer：GCTGCCAACATCATCCAGGAAGG；anti-sense primer: TGATGCCAGAGCGGCTACTCAG)；IL-1β(sense primer：CAGCAGCATCTCGACAAGAG；anti-sense primer: AAAGAAGGTGCTTGGGTCCT)；GAPDH(sense primer：AAGGGCTCATGACCACAGTC；anti-sense primer: GGATGCAGGGATGATGTTCT)。PCR反應(yīng)程序：Stage1(預(yù)變性)：Reps：1；95℃ 30 s。Stage2(PCR反應(yīng))：Reps：40；95℃ 5 s、60℃ 34 s。以GAPDH為內(nèi)參，使用2公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果

各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組行為學(xué)評(píng)分均為0分。造模各組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，與假手術(shù)組比，P均<0.01。用藥3、5 d后，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。各造模組評(píng)分隨時(shí)間逐漸下降。見表2。

表2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分分)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)CuZnSOD、nNOS mRNA表達(dá)和MDA含量的結(jié)果

各時(shí)間點(diǎn)模型組腦組織CuZnSOD mRNA表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組明顯高于模型組(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織CuZnSOD mRNA表達(dá)量

注：與正常組相比，$$P<0.01，$P<0.05；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

各時(shí)間點(diǎn)模型組腦組織nNOS mRNA表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)量

注：與正常組相比，$$P<0.01；與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比，##P<0.01

各時(shí)間點(diǎn)模型組腦組織MDA含量均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05，P<0.01)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腦組織MDA含量

注：與正常組相比，$P<0.05，$$P<0.01；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.3 炎性因子TLR-4、IL-1β mRNA表達(dá)結(jié)果

用藥1、5 d，模型組腦組織TLR-4 mRNA表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.05)。

用藥1 d，模型組腦組織IL-1β mRNA表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.01)。用藥5 d，模型組腦組織IL-1β mRNA表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。見表6。

表6 各組大鼠腦組織TLR-4、IL-1β mRNA表達(dá)量

注：與正常組相比，$$P<0.01，$P<0.05；與假手術(shù)組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05

4 討論

超氧化物歧化酶(SOD)能夠利用氧化還原金屬將超氧化物轉(zhuǎn)化成氧和過氧化氫，過氧化氫又被過氧化氫酶和過氧化物酶立即分解成無害的水，形成機(jī)體內(nèi)天然存在的抗氧化機(jī)制[6]。脂質(zhì)是氧化應(yīng)激涉及最多的生物靶點(diǎn)，其氧化過程中會(huì)產(chǎn)生許多二級(jí)產(chǎn)物，這些產(chǎn)物主要是醛類如丙二醛(MDA)等，這些醛類持續(xù)存在且有高反應(yīng)活性，易于產(chǎn)生高毒性分子，與核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)的活化與去活化來調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)的含量，從而調(diào)節(jié)腦部血流。腦出血后血腫周圍會(huì)出現(xiàn)不同程度的腦血流量改變，缺血缺氧后引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)迅速產(chǎn)生大量NO，過量的NO會(huì)成為神經(jīng)毒性物質(zhì)。同時(shí)，NO作為信號(hào)分子，能夠啟動(dòng)全身的炎癥反應(yīng)，抑制nNOS活性是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要手段。TLR-4是各級(jí)炎性信號(hào)通路的初始開關(guān)，可激活下游NF-κB信號(hào)通路釋放大量炎癥因子，這些炎癥因子如IL-1β可直接或間接參與腦出血炎性反應(yīng)[8]。IL-1β在繼發(fā)性腦損傷過程中大量分泌，可進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，破壞血腦屏障通透性，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而又加重腦水腫等繼發(fā)性腦損害，在惡性循環(huán)的腦損傷過程中炎性反應(yīng)可級(jí)聯(lián)放大[9]。路夢(mèng)茹[10]等研究發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞內(nèi)TLR-4表達(dá)后，可有效阻止TLR-4及下游炎癥因子IL-1β、IL-6等的信號(hào)傳遞和表達(dá)，從而減輕腦出血炎癥損傷。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠的腦出血模型來觀察神經(jīng)功能修復(fù)水平，并測(cè)定可反映氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，試從抗氧化和抗炎方面解釋涼血通瘀方對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)涼血通瘀方干預(yù)后的腦出血大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低，神經(jīng)功能缺損情況明顯改善。模型組在各時(shí)間點(diǎn)MDA含量和nNOS基因表達(dá)增高、CuZnSOD基因表達(dá)降低，表明腦出血后氧化應(yīng)激反應(yīng)活躍，超氧陰離子清除率降低，損傷血管和細(xì)胞功能。模型組造模后第1天和第5天TLR-4、IL-1β基因表達(dá)均明顯升高，表明炎癥反應(yīng)與腦出血息息相關(guān)，腦出血后腦損傷激活TLR-4大量表達(dá)后激活下游的IL-1β大量表達(dá)，損害腦功能。涼血通瘀方對(duì)比模型組，在不同時(shí)間點(diǎn)明顯降低MDA含量和nNOS、TLR-4、IL-1β基因表達(dá)，提高CuZnSOD基因表達(dá)，發(fā)揮了抗氧化和抗炎作用。

綜上所述，涼血通瘀方能夠減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，有效清除氧自由基，抑制炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，從而保護(hù)腦出血后的神經(jīng)功能。本實(shí)驗(yàn)為名老中醫(yī)的有效驗(yàn)方的使用提供了現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。