黃 寬，向潤(rùn)清，林艾和，張艷嬌，范 源,2△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216）

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實(shí)，是藏族習(xí)用藥材。其性味甘、酸、澀、涼；歸肺、胃經(jīng)；具有清熱涼血，消食健胃，生津止渴的功效；常用于治療血熱血瘀、咳嗽、喉痛、口干、消化不良、腹脹等[1]。余甘子中富含多酚鞣質(zhì)類、黃酮類、有機(jī)酸、維生素、氨基酸等活性成分[2]，以多酚類鞣質(zhì)含量最多[3]，具有抗菌[4-5]、抗炎[6]、抗病毒[7]、抗腫瘤[8-10]、抗氧化[11-15]、降血糖[16]等藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸和其酯類衍生物可作為一種有價(jià)值的抗癌藥物[17-18]。沒食子酸（Gallica acid，GA）、焦性沒食子酸 （Pyrogallic acid，PA）、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟牵?，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟?（1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，β-PGG）屬天然水解類鞣質(zhì)，沒食子鞣質(zhì)極不穩(wěn)定，容易在酸、堿、酶的催化作用下水解，生成沒食子酸和多元醇。GA為弱酸性物質(zhì)，在高溫或催化條件下還原脫羧后可生成焦性沒食子酸。β-PGG在酸、堿條件下發(fā)生水解，逐步生成四沒食子酰葡萄糖、TGG、二沒食子酰葡萄糖、葡萄糖和沒食子酸[19]。余甘子作為藥食兩用的傳統(tǒng)習(xí)用民族藥物，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥效明確，目前其加工利用主要有果汁、果肉制成的飲料、果脯、果酒、果醬，其種子和提取物也常作為食品或添加劑使用[20]。但余甘子在我國(guó)的開發(fā)利用度還相對(duì)較低，為使其有效物質(zhì)活性高，且不出現(xiàn)褐變反應(yīng)，溶劑pH值尤為關(guān)鍵。本研究以提高余甘子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為目的，以期獲得有效控制余甘子質(zhì)量的方法。

圖1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；語路超聲波清洗機(jī)（深圳市即潔超聲科技有限公司）；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（永康式速鋒工貿(mào)有限公司）；T-1000型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平（Mettler-tolido international trade（Shanghai）co.LTD）。

對(duì)照品：焦性沒食子酸（PA批號(hào)：TS0905CA14，上海源葉生物科技有限公司）、沒食子酸（GA批號(hào)：wkq16081904，四川省維克奇生物科技有限公司）、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟牵═GG 批號(hào)：CFN95043，武漢天植生物技術(shù)有限公司）、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖 （β-PGG 批號(hào)：PRF10011001，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；余甘子（批號(hào)：P20180612，安國(guó)市旭芳中藥材經(jīng)營(yíng)有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～2 min，2%～5%A；3～10 min，5%～10%A；10～26 min，10% ～15%A；26～45 min，15% ～26%A；45～75 min，26%～35%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按焦性沒食子酸計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 磷酸緩沖液 A液：10 mL磷酸溶液，加水定容至100 mL；B液：7.2 g磷酸氫二鈉加水定容至100 mL。分別取上述不同體積的A液和B液混合配制成不同 pH（2、3、4、5、6、7、8）的磷酸鹽緩沖溶液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇定容。配制各對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為焦性沒食子酸 0.229 mg/mL、沒食子酸 0.148 mg/mL、1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖 0.018 mg/mL、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖 0.031 mg/mL。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取干燥的余甘子粉末2 g，精密加30 mL的70%甲醇，超聲60 min，冷卻后用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾，濾液濃縮后用甲醇定容至25 mL，備用。用移液槍分別移取1 mL置于6個(gè)樣品瓶中，再分別加入 1 mL pH 為 2、3、4、5、6、7、8 的磷酸緩沖液，搖勻靜置，即得不同pH條件下的供試品溶液。

2.2.4 空白樣品溶液 因最終定容時(shí)所用的溶劑為甲醇，故本研究中以甲醇作為空白溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下依次連續(xù)進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mAU*s）為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明各成分均具有良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示PA、GA、TGG、β-PGG峰面積RSD分別為0.72%、0.92%、1.15%、1.30%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于 2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，結(jié)果顯示PA、GA、TGG、β-PGG 10 h內(nèi)峰面積的 RSD 值分別為1.21%、1.24%、1.11%、1.65%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批余甘子粉末6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果顯示PA、GA、TGG、β-PGG含有量RSD分別為1.71%、1.15%、1.77%、1.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批余甘子樣品粉末9份，每份精密稱取2 g，分別按照藥材含有量的80%、100%、120%加入混合對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果見表2。

2.8 含量測(cè)定 取3份不同批次余甘子樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣，計(jì)算4種成分含有量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n=9）

表3 含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

2.9 不同pH條件下含量變化 在緩沖液pH值為2～5的區(qū)間，隨著pH的增大，PA含量呈逐漸減少的趨勢(shì)；pH值為5～6的區(qū)間，隨著pH的增大，PA含量呈逐漸增加的趨勢(shì)；pH值為6～8的區(qū)間，隨著pH的增大，PA含量逐漸減少，且當(dāng)pH值為2時(shí)，在所測(cè)pH值范圍中含量達(dá)到最高。在緩沖液pH值為2～5的區(qū)間，隨著pH的增大，GA含量逐漸增加；pH值為5～6的區(qū)間，隨著pH的增大，GA含量急劇減少；pH值為6～8的區(qū)間，隨著pH的增大，GA含量逐漸下降，且當(dāng)pH值為5時(shí)，在所測(cè)pH值范圍中含量達(dá)到最高。在緩沖液pH值為2～4的區(qū)間，隨著pH的增大，TGG含量逐漸增加；pH值為4～8的區(qū)間，隨著pH的增大，TGG含量逐漸減少；且當(dāng)pH值為4時(shí)，在所測(cè)pH值范圍中含量達(dá)到最高。在緩沖液pH值為2～3的區(qū)間，隨著pH的增大，β-PGG含量逐漸增加；pH值為3～5的區(qū)間，隨著pH的增大，PGG含量逐漸減少；pH值為5～8的區(qū)間，隨著pH的增大，PGG含量緩慢增加隨后逐漸減少，且當(dāng)pH值為3時(shí)，在所測(cè)pH值范圍中含量達(dá)到最高。結(jié)果見表4和圖2。

表4 不同pH條件下余甘子中GA、PA、TGG、β-PGG的含量變化（mg/g）

圖3 不同pH條件下余甘子中4種成分含量變化

3 討論

云南省是主要的余甘子野生資源分布區(qū)[21]，余甘子作為一種多民族習(xí)用藥材，具有廣泛的藥學(xué)應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)多酚鞣質(zhì)類類化合物易分解的化學(xué)性質(zhì)，本研究測(cè)定不同pH條件下余甘子中PA、GA、TGG和β-PGG的含量變化，4種成分的測(cè)定可以為豐富和完善余甘子的質(zhì)控體系提供參考。結(jié)果表明在pH 2～8之間，PA含量隨pH的增大而減小，原因可能是PA在堿性條件下分解，隨著pH升高，其分解增加，在pH為6時(shí)，可能是因?yàn)镚A分解產(chǎn)生的PA，PA含量稍有增加；GA含量隨pH的增大而減少，在pH為5時(shí)含量最高，可能是由于β-PGG在酸性條件下水解，隨著pH升高，GA含量減少；TGG含量隨著pH增大含量增加，原因可能是β-PGG分解導(dǎo)致的含量增加，在pH為4時(shí)含量達(dá)到最高；β-PGG含量隨著pH的增大而減小，可能是β-PGG自身水解的原因。

余甘子作為主產(chǎn)于云南的常用藏方三果湯其中的一味，具有潛在而大的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同pH條件下余甘子中PA、GA、TGG及β-PGG含量變化進(jìn)行了研究，可為余甘子相關(guān)成分的質(zhì)控、提取加工以及養(yǎng)護(hù)提供一定的理論參考。