郭大鵬 賀建東 韓沖芳 王一珍 王志豪 王 慧

缺血性心血管疾病已成為威脅人類健康的重要?dú)⑹?，目前主要的治療措施是恢?fù)缺血心肌的有效灌注。然而缺血心肌在恢復(fù)血液灌注后其缺血性損傷可能進(jìn)一步加重，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。而七氟醚作為臨床中常用的吸入麻醉藥，被證實(shí)具有減輕非糖尿病大鼠MIRI的保護(hù)作用[2]。線粒體自噬是指細(xì)胞通過自噬的機(jī)制選擇性地清除線粒體的過程，維持適度的線粒體自噬水平對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)及正常生理功能具有重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚后處理減輕大鼠MIRI的機(jī)制與線粒體自噬關(guān)系密切[4]。糖尿病作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，并且糖尿病患者發(fā)生MIRI較非糖尿病患者更為嚴(yán)重[5]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病因素可降低或取消七氟醚后處理的心肌保護(hù)作用，其機(jī)制尚有待于深入研究[6,7]。本研究擬通過建立糖尿病模型和心肌缺血再灌注模型，從線粒體自噬角度探討糖尿病因素影響七氟醚后處理心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

材料與方法

1.動(dòng)物的選擇及分組：清潔級(jí)健康雄性SD大鼠32只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均符合山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)相關(guān)規(guī)定，適應(yīng)性觀察1周。以是否糖尿病與是否給予七氟醚后處理進(jìn)行兩因素(2×2)析因設(shè)計(jì)，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組(n=8),即非糖尿病缺血再灌注組(NI/R組)、非糖尿病七氟醚后處理組(NSP組)、糖尿病缺血再灌注組(DMI/R組)和糖尿病七氟醚后處理組(DMSP組)。

2.糖尿病大鼠模型的建立：參照參考文獻(xiàn)[8]的方法制備大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后，禁食不禁飲8h，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，批號(hào)：S1030，美國(guó)Sigma公司)30mg/kg，72h后尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖。以血糖≥16.7mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀為模型制備成功。

3.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立：參照參考文獻(xiàn)[2]介紹的方法，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支血流30min再灌注120min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。SD大鼠術(shù)前禁食8h，不禁飲。經(jīng)1%戊巴比妥鈉(75mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰臥位固定，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖電極，接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開，于氣管插管成功后連接ALC-V8型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)行機(jī)械通氣，潮氣量8ml/kg，通氣頻率60次/分，吸呼比1∶2，呼吸機(jī)進(jìn)氣口連接七氟醚揮發(fā)罐(德國(guó)Draeger公司)，呼吸機(jī)出氣口連接Vamos麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(德國(guó)Draeger公司)，吸入氧濃度33%(氧流量3L/min)。于左側(cè)第4、5肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟及左心耳。以8-0帶線縫合針于動(dòng)脈圓錐靠近左心耳下緣水平處(冠狀動(dòng)脈左前降支根部1～2mm)進(jìn)針穿線；穿線后將絲線兩頭穿過硅膠管，平衡15min后用血管鉗向前收緊硅膠管造成左冠狀動(dòng)脈前降支缺血，以心電圖示ST段抬高、T波高聳、心肌組織顏色逐漸變暗為缺血成功標(biāo)志。缺血30min時(shí)松開結(jié)扎線恢復(fù)灌注，以心電圖示ST段明顯下降，心肌缺血區(qū)恢復(fù)紅潤(rùn)為再灌注成功的標(biāo)志。其中NSP組和DMSP組于再灌注前1min吸入七氟醚(批號(hào)：18101931，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)，維持呼氣末濃度2.5%，持續(xù)5min。

4.血清cTnI濃度測(cè)定：于再灌注120min時(shí)，經(jīng)頸動(dòng)脈采血3ml，4℃冰箱靜置30min后，以3500r/min離心10min，離心半徑15cm，取血清置于-20℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)cTnI濃度，試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司。

5.TTC法測(cè)定心肌梗死面積：于再灌注120min時(shí)，再次收緊套管阻斷冠脈血流，頸靜脈注射1%伊文藍(lán)染液2ml后處死大鼠，快速取出心臟，于-20℃冰箱放置2h，用心臟切割器沿心臟長(zhǎng)軸方向?qū)⑵淝谐珊穸燃s為2mm的薄片，行TTC染色，恒溫水浴鍋孵育15min，PBS緩沖液3次后10%甲醛固定24h。拍照后采用Image ProPlus5.0軟件進(jìn)行分析，測(cè)定梗死區(qū)面積(即灰白色區(qū)域)與存活區(qū)面積(即磚紅色區(qū)域)，計(jì)算心肌梗死面積=梗死區(qū)面積/存活區(qū)面積。

6.心肌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡下觀察：于再灌注結(jié)束時(shí)處死大鼠并取心肌組織，切取約1mm3左心室組織置于2.5%戊二醛固定液(0.1mol/L磷酸緩沖液配制，pH值7.4)中，4℃固定2h，經(jīng)0.1mol/L 磷酸緩沖液漂洗后，用1%鋨酸固定液(0.1mol/L 磷酸緩沖液配制，pH值7.4)，4℃固定2h，組織塊經(jīng)遞增濃度的乙醇脫水后用Spurr 樹脂浸透包埋，70℃聚合8h，超薄切片機(jī)切片，切片經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，采用JEM-1011型透射電子顯微鏡觀察左心室心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及線粒體自噬的情況。

7.Western blot法檢測(cè)心肌線粒體自噬蛋白表達(dá)：取心尖組織，使用4℃預(yù)冷的PBS清洗組織兩次，去除組織中殘留血液；研磨、裂解提取組織蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(批號(hào)：23225，美國(guó)Thermo Scientific公司)采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。蛋白樣品上樣30μg，電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至PVED膜，室溫封閉2h，然后加入一抗LC3(1∶800，美國(guó)Cell Signaling公司)、p62(1∶1000，美國(guó)Cell Signaling公司)和Parkin(1∶800，美國(guó)Abcam公司)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次后二抗GAPDH室溫孵育2h，TBST再洗滌3次，使用ECL試劑盒(批號(hào)：1705060, 美國(guó)BIO-RAD公司)避光反應(yīng)3～5min，化學(xué)光敏模式曝光顯影，采用Image J圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平差異。

結(jié) 果

1.心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變：電子顯微鏡下，NI/R組線粒體大小不均，排列紊亂，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂，基質(zhì)紊亂，線粒體出現(xiàn)腫脹，可見線粒體自噬體，心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重；與NI/R組比較，NSP組線粒體結(jié)構(gòu)較完整，線粒體輕度腫脹，損傷較輕；而與NI/R組比較，DMI/R組和DMSP組線粒體損傷明顯加重，排列極紊亂，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂，基質(zhì)紊亂，線粒體腫脹更加明顯，空泡化、片段化變形嚴(yán)重，心肌細(xì)胞損傷更嚴(yán)重，詳見圖1。

圖1 4組大鼠心肌組織電鏡結(jié)果(透射電鏡，×20000)

2.析因方差結(jié)果：非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠發(fā)生心肌缺血再灌注時(shí)血清cTnI濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.908，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組血清cTnI濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.755，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者在血清cTnI濃度存在交互效應(yīng)(F=4.716，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠心肌梗死面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=237.070，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組心肌梗死面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.291，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者對(duì)心肌梗死面積存在交互效應(yīng)(F=3.191，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠LC3比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=461.409，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組LC3比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.860，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理兩因素在LC3比值上存在交互效應(yīng)(F=30.195，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠p62含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=173.962，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組p62含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.281，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者在p62含量上存在交互效應(yīng)(F=54.083，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠Parkin含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=144.244，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組Parkin含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.919，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者在Parkin含量存在交互效應(yīng)(F=25.844，P<0.05，表1，圖2)。

表1 析因試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

圖2 析因試驗(yàn)結(jié)果的交互作用圖A.cTnI;B.心機(jī)梗死；C.LC3;D.p62;E.Parkin

3.4組大鼠各指標(biāo)的比較：與NI/R組比較，NSP組血清cTnI濃度降低，心肌梗死面積減少，心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表達(dá)下調(diào)，p62的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。與NI/R組比較，DMI/R組血清cTnI濃度升高，心肌梗死面積增加，心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表達(dá)下調(diào)，p62的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。與NSP組比較，DMSP組血清cTnI濃度升高，心肌梗死面積增加，心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表達(dá)下調(diào)，p62的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。與DMI/R組比較，DMSP組血清cTnI濃度、心肌梗死面積、心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Parkin和p62的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 4組大鼠血清cTnI、心肌梗死面積及各蛋白表達(dá)比較

討 論

本研究參照參考文獻(xiàn)[8]的方法，以高脂高糖飼養(yǎng)和腹腔小劑量注射鏈脲佐菌素的方法制備大鼠2型糖尿病模型，并以給藥后72h的空腹血糖≥16.7mmol/L，出現(xiàn)多飲多食多尿癥狀為糖尿病模型制備成功。參照參考文獻(xiàn)[2]介紹的方法，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支血流30min再灌注120min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，心電圖中ST段與T波的陽性表現(xiàn)及心肌病理學(xué)損傷加重，表明大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。

線粒體是真核生物進(jìn)行能量代謝的重要場(chǎng)所，并且參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程[9,10]。通過線粒體自噬清除受損或不需要的線粒體，對(duì)于維持線粒體的穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞生存具有重要意義。線粒體自噬的調(diào)控有多條信號(hào)通路的參與，PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究較深入的信號(hào)通路。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于線粒體外膜。Parkin是一種E3泛素酶，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。線粒體功能正常時(shí)，PINK1通過線粒體膜上的轉(zhuǎn)位酶轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜降解。當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，聚集于線粒體外膜。PINK1在線粒體外膜的積聚將誘導(dǎo)具有E3泛素連接酶活性的Parkin由胞質(zhì)移位到損傷的線粒體，使線粒體外膜的特異性底物蛋白泛素化并募集p62蛋白，進(jìn)而與自噬蛋白LC3結(jié)合，胞質(zhì)型LC3(即LC3Ⅰ)被脂質(zhì)化為膜型LC3(即LC3Ⅱ)，介導(dǎo)泛素化的底物進(jìn)入自噬體，啟動(dòng)線粒體自噬以清除受損線粒體[11,12]。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低[13]。P62在細(xì)胞質(zhì)中與LC3Ⅱ形成復(fù)合物，發(fā)生自噬時(shí)被溶酶體降解，表達(dá)水平降低，與自噬水平呈負(fù)相關(guān)[14]。析因試驗(yàn)結(jié)果的方差分析顯示，七氟醚后處理在大鼠血清cTnI濃度、心肌梗死面積、心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Parkin的表達(dá)都存在主效應(yīng)，通過七氟醚后處理，大鼠血清cTnI濃度降低，心肌梗死面積減少，心肌自噬蛋白LC3、Parkin表達(dá)減少，p62表達(dá)增多，提示線粒體自噬水平降低，心肌缺血再灌注損傷減輕，七氟醚后處理的心肌保護(hù)作用可能與抑制過度激活的線粒體自噬有關(guān)。

糖尿病心血管系統(tǒng)損傷是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一[15]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病因素在大鼠血清cTnI濃度、心肌梗死面積、心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Parkin的表達(dá)上具有主效應(yīng)，糖尿病大鼠組的血清cTnI濃度升高，心肌梗死面積增加，心肌自噬蛋白LC3、Parkin表達(dá)減少，p62表達(dá)增多，心肌缺血再灌注損傷加重，但心肌線粒體自噬水平降低，提示糖尿病因素可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體自噬過程受阻，心肌細(xì)胞未能及時(shí)清除缺血再灌注過程中受損或功能障礙的線粒體，進(jìn)而增加活性氧的釋放，加重心肌缺血再灌注損傷。適度的線粒體自噬水平對(duì)于維持心臟的正常生理功能具有重要作用，自噬過程受阻會(huì)導(dǎo)致受損傷的線粒體未能及時(shí)清除進(jìn)而加重心肌損害；線粒體自噬過度又會(huì)導(dǎo)致線粒體減少供能不足。七氟醚后處理減輕非糖尿病大鼠的缺血再灌注損傷，但對(duì)于糖尿病大鼠心肌保護(hù)作用失效，其機(jī)制可能與糖尿病大鼠線粒體自噬水平降低有關(guān)。鑒于本研究為在體實(shí)驗(yàn)，無法排除神經(jīng)體液因素的影響，因此有待于開展離體實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，七氟醚后處理對(duì)糖尿病大鼠的心肌保護(hù)作用減弱，其機(jī)制可能與糖尿病大鼠的心肌線粒體自噬水平降低有關(guān)。