李 明 秦 聰

在過去10年里，腎癌發(fā)展為第7大常見腫瘤，而且確診時(shí)，大約30%的患者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。對(duì)于進(jìn)展性腎癌，免疫治療或分子靶向治療可以一定程度上改善患者的生存率，但其細(xì)胞毒性卻不可避免[2，3]。傳統(tǒng)中藥發(fā)展迅速，在減少腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、延長患者的生存時(shí)間和提高患者生活質(zhì)量等方面發(fā)揮越來越重要的作用[4]。同時(shí)以往研究發(fā)現(xiàn)，中藥提取物苦豆堿可通過抑制Erk1/2蛋白磷酸化，從而抑制膀胱癌EJ細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[5]。也有其他研究發(fā)現(xiàn)，苦豆堿可以通過抑制Akt和ERK蛋白磷酸化從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，可通過激活caspase-3從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，可通過p53/p21信號(hào)通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞周期阻滯，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的活性[6]。然而，苦豆堿對(duì)腎癌細(xì)胞的作用目前尚無相關(guān)研究，本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)觀察苦豆堿對(duì)腎癌A498細(xì)胞的殺傷作用并初步探討其作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料：人腎癌A498細(xì)胞購于ATCC細(xì)胞庫，苦豆堿(ab143290)購于英國Abcam公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購于美國BD公司，Bax(ab32503)一抗購于英國Abcam公司，cleaved caspase-3(#9661)一抗購于美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH(ab181602)一抗購于英國Abcam公司，羊抗兔熒光二抗購于美國LI-COR公司，胎牛血清購于美國Sciencell公司，青霉素-鏈霉素購于杭州吉諾公司，BPMI-1640培養(yǎng)基購于杭州吉諾公司，胰蛋白酶購于美國Gibco公司。

2.腎癌A498細(xì)胞的培養(yǎng)與處理：腎癌A498細(xì)胞用含有10%的胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)分為3組：苦豆堿0mmol/L組、苦豆堿0.2mmol/L組和苦豆堿0.4mmol/L組，通過CCK8法檢測各組細(xì)胞存活率，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，通過Western blot法檢測各組細(xì)胞Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

3.CCK8法檢測各組細(xì)胞存活率：在96孔板接種100μl的A498細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞24h。24h后，去除培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中每個(gè)孔中加入100μl的含有不同濃度苦豆堿的培養(yǎng)液。然后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。之后，向培養(yǎng)板中每孔加入10μl的CCK8溶液。然后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育60min。最后，用酶標(biāo)儀檢測各組樣品450nm處的吸光度(A)值。

4.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化：在6孔板接種相同數(shù)量的A498細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞24h。24h后，去除培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中每個(gè)孔中加入含有不同濃度苦豆堿的培養(yǎng)液。然后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。最后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變并拍照。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平：在6孔板接種相同數(shù)量的A498細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞24h。然后，去除培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中每個(gè)孔中加入含有不同濃度苦豆堿的培養(yǎng)液。然后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。用離心管收集上清液，之后每個(gè)孔加入0.5ml胰蛋白酶消化3min，用上清液終止消化并收集全部細(xì)胞，然后用離心機(jī)離心細(xì)胞，取雙蒸水將10×Bingding Buffer稀釋為1×，取100μl的1×Bingding Buffer將細(xì)胞重懸。然后，每管加入5μl的PE、5μl的7-AAD溶液?；靹蚝?，室溫避光孵育15min。然后，每孔加入400μl的1×Bingding Buffer。最后，流式上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡水平。

6.Western blot法檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平：蛋白樣品制備：在6孔板接種相同數(shù)量的A498細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞24h。24h后，去除培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中每個(gè)孔中加入含有不同濃度苦豆堿的培養(yǎng)液。然后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。用離心管收集上清液，之后每個(gè)孔加入0.5μl胰蛋白酶消化3min，用上清液終止消化并收集全部細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞5min，用BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液移后至離心管100℃加熱10min，使蛋白變性。凝膠的配制：SDS-PAGE凝膠試劑盒購于武漢賽維爾公司，按照說明書配制15ml濃度為12%的分離膠，放置30min，然后配制6ml濃度為5%的濃縮膠，插入梳子放置20min后拔下梳子。蛋白上樣與電泳：將提前配制好的電泳液倒入電泳槽中，蛋白樣本加入上樣孔。電泳時(shí)，濃縮膠電壓為70V，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至90～100V。溴酚藍(lán)進(jìn)入底層膠時(shí)停止電泳。轉(zhuǎn)膜：切割適當(dāng)大小的PVDF膜，在甲醇中激活2min，切下膠片，將膜貼在相應(yīng)分子量位置。轉(zhuǎn)膜電流200mA，冰上進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜時(shí)間大約60min。封閉：配制5%脫脂奶粉封閉液，將膜放到TBS溶液中漂洗后，將膜放入封閉液中，搖床上搖動(dòng)1h。一抗的孵育：Bax(1∶1000)、cleaved caspase-3(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)，用一抗稀釋液稀釋。取出膜，用TBS清洗2遍，然后，將膜放入相應(yīng)的一抗溶液中，4℃搖床上過夜。二抗的孵育：將膜取出，用TBS溶液清洗3遍，每遍8min。將膜放到二抗溶液中，搖床上室溫避光孵育1h。之后，將條帶取出放到TBS溶液中清洗3遍，每遍8min。蛋白檢測：通過Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，讀取灰度值。

結(jié) 果

1.CCK8檢測結(jié)果：苦豆堿0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L組細(xì)胞存活率分別為：100%、74%±10%和40%±8%?？喽箟A0.2mmol/L和0.4mmol/L組細(xì)胞存活率與苦豆堿0mmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.009和0.000，圖1)。而且，苦豆堿0.4mmol/L組細(xì)胞存活率與苦豆堿0.2mmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009，圖1)。以上數(shù)據(jù)表明，苦豆堿0.2mmol/L和0.4mmol/L可明顯抑制A498細(xì)胞增殖，且呈劑量效應(yīng)。

圖1 各組細(xì)胞存活率不同濃度的苦豆堿(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入A498細(xì)胞48h后各組細(xì)胞存活率。與0mmol/L組比較，*P<0.05；與0.2mmol/L組比較，#P<0.05

2.倒置顯微鏡觀察結(jié)果：苦豆堿0mmol/L組中細(xì)胞充滿活力，平鋪排列有序，細(xì)胞凋亡數(shù)量極少?？喽箟A0.2mmol/L、0.4mmol/L組，細(xì)胞數(shù)量減少，大量細(xì)胞變圓，漂浮細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞凋亡明顯，且隨著苦豆堿濃度升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加(圖2)?？喽箟A濃度為0.2mmol/L、0.4mmol/L可以促進(jìn)A498細(xì)胞凋亡，且呈劑量效應(yīng)。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：苦豆堿0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L組細(xì)胞凋亡率分別是：5.23%、33.10%和51.50%，苦豆堿0.2mmol/L、0.4mmol/L組與苦豆堿0mmol/L組比較，細(xì)胞凋亡率明顯增加，且呈劑量效應(yīng)(圖3)。苦豆堿0.2mmol/L、0.4mmol/L可使A498細(xì)胞凋亡率增加，且呈劑量效應(yīng)。

圖2 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×100)不同濃度的苦豆堿(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入A498細(xì)胞48h后明場下細(xì)胞形態(tài)的變化;A.0mmol/L;B.0.2mmol/L;C.0.4mmol/L

圖3 各組細(xì)胞凋亡率不同濃度的苦豆堿(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入A498細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡率的變化;A.0mmol/L;B.0.2mmol/L;C.0.4mmol/L

4.Western blot法檢測結(jié)果：苦豆堿0.2mmol/L和0.4mmol/L組較苦豆堿0mmol/L組的Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Bax蛋白P值分別為0.001和0.000；cleaved caspase-3蛋白P值分別為0.001和0.000，圖4)。而且，苦豆堿0.4mmol/L組較苦豆堿0.2mmol/L組Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Bax蛋白P=0.001；cleaved caspase-3蛋白P=0.002，圖4)。苦豆堿濃度為0.2mmol/L、0.4mmol/L可促進(jìn)A498細(xì)胞Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，且呈劑量效應(yīng)。

圖4 凋亡蛋白表達(dá)量變化不同濃度的苦豆堿(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入到A498細(xì)胞48h后凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表達(dá)量的變化。與0mmol/L組比較，*P<0.05；與0.2mmol/L組比較，#P<0.05

討 論

目前臨床治療腎癌的化療藥物有多種，然而腎癌的存活率和復(fù)發(fā)率仍堪憂[7]。同時(shí)，在抗腎癌治療過程中，目前常用化療藥物的不良反應(yīng)和耐藥性也是一個(gè)難題。因此，從天然植物中提取具有抗腫瘤活性的化合物也是抗腫瘤治療的有效途徑之一。

苦豆堿是從藥用植物苦豆子中提取的一種生物堿，研究表明苦豆堿具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗病毒和抗氧化等作用[8～12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，苦豆堿具有血管舒張作用，苦豆堿可以改善實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦損傷[13,14]。苦豆堿對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓具有保護(hù)作用，苦豆堿也可以抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心臟肥厚[15,16]。在小鼠肺纖維化模型中，苦豆堿可以抑制成纖維細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[17]。目前，多項(xiàng)研究已證實(shí)了苦豆堿抑制腫瘤活性方面的作用。Tian等[9]研究發(fā)現(xiàn)，苦豆堿可阻斷Ras信號(hào)通路，抑制Raf1和Erk1/2的磷酸化，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡?？喽箟A可以抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其侵襲[10]。而且，苦豆堿可通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M周期停滯以及激活線粒體死亡途徑發(fā)揮抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。然而，苦豆堿在腎癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制尚無相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)筆者首次證實(shí)了傳統(tǒng)中藥提取物——苦豆堿的體外抗腎癌作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.2mmol/L的苦豆堿作用于腎癌A498細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變圓，細(xì)胞出現(xiàn)漂浮，細(xì)胞生長受到抑制，并且隨著苦豆堿濃度升高，在0.4mmol/L濃度時(shí)，漂浮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞凋亡數(shù)量大大增加，表明苦豆堿在一定濃度下可以抑制A498細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。

同時(shí)，筆者用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度苦豆堿作用于腎癌A498細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)隨著苦豆堿濃度的升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，凋亡率明顯升高。Western blot法檢測的Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量也隨著苦豆堿濃度的升高而增加。以上結(jié)果表明，體外實(shí)驗(yàn)中一定濃度的苦豆堿能夠誘導(dǎo)腎癌A498細(xì)胞凋亡，且隨著藥物濃度的增加，誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)更加明顯。這一結(jié)果與上述細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測結(jié)果一致，也與其他研究者發(fā)現(xiàn)的苦豆堿可抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤、膀胱癌等多種癌細(xì)胞株增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相似。

綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)中苦豆堿對(duì)腎癌A498細(xì)胞具有較好殺傷作用，苦豆堿可以抑制腎癌A498細(xì)胞的增殖，并增加Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中苦豆堿對(duì)腎癌A498細(xì)胞的作用效果顯著，將來有望成為新的抗腎癌藥物。