劉翠云，胡長龍

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

哺乳動物電壓門控鉀離子通道(Kv)由12個亞家族(Kv1-12)構(gòu)成,包括40個亞型.它們在膜電位維持以及介導(dǎo)神經(jīng)元和肌肉的興奮性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用,并且與多種神經(jīng)和心血管疾病密切相關(guān)[1-3].從果蠅到脊椎動物,電壓門控鉀離子通道的結(jié)構(gòu)高度保守[4].電壓門控鉀離子通道是四聚體結(jié)構(gòu),通過4個α亞基形成一個對鉀離子具有選擇性的孔道,每一個α亞基由6個跨膜螺旋(S1～S6)構(gòu)成,且S5和S6之間通過P環(huán)連接,它們構(gòu)成螺旋孔以及離子選擇區(qū)域.電壓門控鉀離子通道在去極化時被打開,隨著去極化時間的延長,隨后進入失活狀態(tài).

電壓門控鉀離子通道的Kv2亞家族包括Kv2.1和Kv2.2兩種亞型,它們對神經(jīng)元電興奮性和膜電位維持起重要的調(diào)控作用[5-6].Kv2.1普遍存在于哺乳動物大腦中,它通過控制膜電位的去極化和超極化來調(diào)控神經(jīng)元的興奮性[7-8];Kv2.2主要在前腦基底斜方體的中間核中表達[9],相比于Kv2.1,它的功能和生物學(xué)作用有待充分的探索.研究表明Kv2.1與多種病理和生理功能有關(guān).例如，Kv2.1可以調(diào)控人體胰島中胰島素的分泌,即促進胰島素的胞吐作用,揭示了該通道結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致人體胰島素分泌途徑受損,引發(fā)糖尿病[10-11];正常的衰老過程以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生伴隨著Kv2.1的氧化[12];Kv2.1可以介導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡[13-14];Kv2.1功能的缺失會增加阿爾茨海默病小鼠模型中海馬神經(jīng)元的興奮性,最終促成興奮性毒性損傷[15].另外,越來越多的研究表明Kv2.2與睡眠周期的調(diào)控有關(guān)[16];Kv2.2參與胰島對胰島素和生長抑素釋放的調(diào)控[17];對噪音引起的聽力損傷也具有保護作用[18].Kv2通道的功能與通道失活特性及離子選擇性高度相關(guān).

電壓門控鉀通道有兩種失活類型： N-type和C-type[19].這兩種類型的主要失活機制是不同的,與N-type有關(guān)的結(jié)構(gòu)域位于胞質(zhì)中的氨基末端,N-type的失活機制可以用ball-and-chain模型來解釋[20-21].目前認為C-type失活與選擇性濾器周圍的構(gòu)象變化以及與其靠近的部分胞外結(jié)構(gòu)有關(guān)[22-25],且在C-type失活的過程中,4個亞基都會參與其中,共同協(xié)作,使孔道外口收縮[26].通道所處的離子環(huán)境也會影響C-type的特性,在哺乳動物電壓門控鉀離子通道中細胞內(nèi)陽離子的種類和濃度可以調(diào)控C-type外向電流失活的速率和幅度[27].在正常的情況下,鉀離子通道可以特異性地允許鉀離子通過,而不允許其他離子通過[28],已有研究結(jié)果表明,Kv通道孔道中的一段保守氨基酸序列-VGYGD-與通道對鉀離子的高度專一選擇性有關(guān),該序列中的V和Y與跨膜區(qū)的W之間的氫鍵和范德華力是調(diào)控的關(guān)鍵[29].Kv通道的失活與離子選擇性高度耦合,從晶體結(jié)構(gòu)上看,Kv2.1和Kv2.2通道中保守序列-VGYGD-中的Y可能與孔道失活相關(guān)結(jié)構(gòu)域中的W之間形成氫鍵.本文通過點突變以及膜片鉗的方法,對這兩個位點的相互作用對通道離子選擇性的影響進行研究,實驗結(jié)果將會為Kv2家族相關(guān)疾病的治療提供重要的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎HEK293細胞,購買自中國科學(xué)院細胞庫(上海,中國);大鼠Kv2.1(由Kcnb1基因編碼),Kv2.2(由Kcnb2基因編碼)通過酶切位點XhoⅠ和EcoRⅠ連入表達載體pEGFP-N1.所用質(zhì)粒突變試劑盒QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit購買自Agilent Technologies公司.基因測序及引物合成服務(wù)由上海睿迪生物公司提供.所用轉(zhuǎn)染試劑盒jetPRIME購買自Polyplus公司.

1.2 方法

1.2.1 點突變與質(zhì)粒擴增

根據(jù)NCBI上的Kcnb1(NM_013186.1),Kcnb2(NM_054000.2)基因序列分別設(shè)計引物(表1)進行擴增.

表1 實驗所用引物

點突變按照質(zhì)粒突變試劑盒中的步驟進行,突變產(chǎn)物通過熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α,挑選單克隆測序,確定測序結(jié)果正確后,大量擴增,使用質(zhì)粒中抽試劑盒(由Axygen提供)抽提質(zhì)粒并測濃度.

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液中,置于CO2濃度為5%的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當HEK293細胞的生長密度達到60%到80%時進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟按轉(zhuǎn)染試劑盒中提供的說明書進行,加入的目的質(zhì)粒的量為2μg,轉(zhuǎn)染24h 后進行實驗.

表2 實驗所用內(nèi)液/外液配方

1.2.3 電生理記錄

HEK293細胞的全細胞電流記錄使用Axon 200B放大器(美國Axon Instruments公司)和pClamp10.2軟件進行記錄.記錄電極(德國Brand公司)經(jīng)垂直拉制儀(Narishige公司Model PC-10 Puller)兩步拉制而成,保證電極充滿內(nèi)液后的阻值范圍是4～6MΩ,記錄時的采樣頻率是10kHz,并以2kHz 濾波器減噪,實驗在室溫下進行.實驗中所用的內(nèi)外液配方見表2.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

電流數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計軟件使用Clampfit10.7和Origin8.0;作圖軟件使用PyMOL 2.2和CorelDRAW12.

2 結(jié)果與分析

2.1 Kv2.1關(guān)鍵位點W366的突變改變通道離子選擇性

Kv1.2/Kv2.1的嵌合通道結(jié)構(gòu)(PDB ID： 2R9R)包括S5到S6的跨膜螺旋以及S4到S5的鏈接螺旋結(jié)構(gòu),通道大小被縮減,孔道區(qū)域結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化,使用PyMOL 2.2軟件分析,顯示在該結(jié)構(gòu)中W363和Y373之間存在距離為2.84?的氫鍵(圖1(a));另外,結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究也表明,W366和Y376(Kv2.1的氨基酸編碼)之間可能會形成氫鍵[30],這組氫鍵很可能影響通道選擇性過濾器的功能,本研究通過實驗的方法驗證了氫鍵的存在.Kv通道亞型眾多,孔道區(qū)域的氨基酸種類高度保守,圖1(b)是本研究涉及的通道亞型及關(guān)鍵氨基酸位點.

圖1 W366位點突變對Kv2.1的影響Fig.1 Effect of W366 mutation on Kv2.1

實驗中激活電流的記錄方法為： 將細胞鉗制于-100mV,以200ms的間隔時間,從-100mV開始,每次遞增10mV給予去極化刺激直到+40mV.野生型Kv2.1的電流記錄結(jié)果如圖1(c),外向鉀電流在+40mV去極化電壓刺激下可達到2000pA左右.將W366突變成A,電流記錄結(jié)果如圖1(d),結(jié)果顯示,在同樣的去極化電壓刺激條件下,突變通道的外向鉀電流幾乎消失,出現(xiàn)200pA左右的內(nèi)向電流,說明該位點的突變改變了通道的離子選擇性.由于氨基酸間的氫鍵和氨基酸結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)都可能是造成通道離子選擇性變化的原因,為探究芳香環(huán)結(jié)構(gòu)對通道離子選擇性變化的影響,隨后將W突變成同樣有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的F,實驗結(jié)果顯示通道依然出現(xiàn)離子選擇性變化(圖1(e)),這說明芳香環(huán)結(jié)構(gòu)不是造成通道離子選擇性變化的原因,而氫鍵的破壞是通道功能發(fā)生變化的主要原因.取不同去極化指令電壓下內(nèi)向電流峰值的均值做I-V曲線(圖1(f)),可得到該內(nèi)向電流是電壓依賴性的,隨著電壓的增大,內(nèi)向電流先增大后減小,當刺激電壓是0mV時電流達到最大.

2.2 Kv2.2關(guān)鍵位點W374的突變改變通道離子選擇性

將Kv2.2的相同位點突變,激活電流的記錄方法同圖1,野生型Kv2.2的電流記錄結(jié)果如圖2(a),外向鉀電流在+40mV去極化電壓刺激下可達到4000pA左右.將W374突變成A,電流記錄結(jié)果如圖2(b),結(jié)果顯示,在同樣的去極化電壓刺激條件下,突變通道的外向鉀電流幾乎消失,出現(xiàn)200pA左右的內(nèi)向電流,說明該位點的突變改變了通道的離子選擇性.為探究芳香環(huán)結(jié)構(gòu)對Kv2.2離子選擇性變化的影響,將W374突變成F,實驗結(jié)果與W374A類似(圖2(c)),說明芳香環(huán)對Kv2.2離子選擇性變化不產(chǎn)生影響,氫鍵的破壞是Kv2.2通道功能變化的主要原因.I-V曲線(圖2(d))表明,突變通道W374A/W374F的內(nèi)向電流也是電壓依賴性的,隨著電壓的增大,電流先增大后減小,電壓為0mV時電流達到最大.圖1和圖2的實驗結(jié)果表明,該位點突變引起的通道離子選擇性變化在Kv2亞家族中具有普遍性.

圖2 W374位點突變對Kv2.2的影響Fig.2 Effect of W374 mutation on Kv2.2

2.3 內(nèi)向電流是鈉離子內(nèi)流產(chǎn)生的

根據(jù)實驗所用外液配方(見表2)分析可知,外液中的鈉離子和鈣離子內(nèi)流都可以產(chǎn)生內(nèi)向電流,隨后實驗中通過控制外液中的離子種類來確定內(nèi)向電流的組成.激活電流的記錄方法同圖1,取+10mV鉗制電壓下的記錄電流.如圖3(a)～(b)所示,當把外液中2.5mmol的鈣離子替換成等濃度的NMDG+,而保持鉀離子和鈉離子濃度不變時,Kv2.1 W366A/W366F內(nèi)向電流相較于對照組沒有顯著性變化,當把外液中140mmol的鈉離子替換成等濃度的NMDG+,而保持鉀離子和鈣離子的濃度不變時,內(nèi)向電流消失.這一結(jié)果表明,突變通道Kv2.1 W366A/W366F產(chǎn)生的內(nèi)向電流主要是鈉離子內(nèi)流造成的.突變通道Kv2.2 W374A/W374F在同樣外液條件下的實驗結(jié)果(圖3(c)～(d)，見第600頁)，也說明通道突變后產(chǎn)生的內(nèi)向電流主要是鈉離子內(nèi)流造成的.

2.4 突變通道對其他一價陽離子通透性的研究

圖3 不同外液離子條件對內(nèi)向電流的影響Fig.3 The influence of ion condition of external liquid on the inward current

圖4 Kv2.2突變型通道對其他一價陽離子的通透性Fig.4 The permeability to other univalent cations of Kv2.2 mutant channel

2.5 關(guān)鍵位點Y376,Y384的突變也會改變通道離子選擇性

如果W363與Y373(Kv1.2/Kv2.1嵌合通道的氨基酸編碼)之間存在氫鍵,則Y376,Y384的突變也會導(dǎo)致氫鍵的破壞,產(chǎn)生和W366,W374突變相似的現(xiàn)象.實驗中我們將Kv2.1的Y376位點和Kv2.2的Y384位點均突變成F,激活電流的記錄方法同圖1,實驗結(jié)果顯示,通道突變后,外向鉀電流消失,出現(xiàn)內(nèi)向電流(圖5(a),(b)).這一結(jié)果表明在在Kv2.1的W366與Y376之間,Kv2.2的W374與Y384之間可能會形成氫鍵,W366和Y376(Kv2.1的氨基酸編碼)分別對通道功能產(chǎn)生影響.根據(jù)不同去極化電壓指令下內(nèi)向電流峰值的均值做I-V曲線(圖5(c),(d)),可得到Kv2.1和Kv2.2該位點突變產(chǎn)生的內(nèi)向電流也具有電壓依賴性,隨著電壓的增大,內(nèi)向電流先增大后減小,當刺激電壓是0mV或10mV時電流達到最大.

圖5 Y376F,Y384F突變對Kv2.1和Kv2.2通道功能的影響Fig.5 The influence of the mutation of Y376F, Y384F on the function of the Kv2.1 and Kv2.2 channels

3 討 論

電壓門控鉀離子通道廣泛分布于神經(jīng)細胞中,參與靜息電位的維持以及動作電位的產(chǎn)生,在神經(jīng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,對電壓門控的鉀離子通道的研究意義深遠.電壓門控鉀離子通道亞型眾多,但是孔道區(qū)域氨基酸的種類在不同物種間保守,本研究主要利用點突變以及膜片鉗記錄的方法對鉀離子通道的孔道區(qū)域的關(guān)鍵保守氨基酸位點進行研究.研究發(fā)現(xiàn),除序列-TVGYG-外,在哺乳動物大鼠鉀離子通道Kv2.1和Kv2.2中,W366與Y376(Kv2.1的氨基酸編碼)之間形成的氫鍵也是調(diào)控鉀離子通道離子選擇性的關(guān)鍵,它的破壞使通道失去鉀離子通透能力,而主要通透鈉離子.

TVGYG序列在電壓門控的鉀離子通道中高度保守,也是電壓門控鉀離子通道的特征序列，早期通過點突變以及缺失突變的方法發(fā)現(xiàn)這一序列尤其是GYG序列在Shaker通道的離子選擇性中起著關(guān)鍵性作用[29,36-37].后續(xù)的晶體結(jié)構(gòu)以及計算機模擬實驗的研究從多方面證實了這一特性序列對電壓門控鉀離子通道離子選擇性的重要性，并進一步探討了其影響離子選擇性的作用機理[38-41].本研究中的突變位點Y376和Y384正是對應(yīng)特征序列TVGYG中的關(guān)鍵Y位點,我們實驗發(fā)現(xiàn)在生理條件下突變通道的離子選擇性發(fā)生顯著改變,進一步說明了從果蠅到哺乳動物大鼠,Y位點在電壓門控鉀離子通道的離子選擇性中的重要作用.

在非生理條件(內(nèi)液中無K+)下,Shaker通道的突變型W434F會使通道失活,同時會通透鈉離子[42-43].同時有研究結(jié)果表明,Shaker通道的突變型W435F對通道的失活和離子選擇性不產(chǎn)生影響[44].本研究發(fā)現(xiàn)在生理條件下,Kv2.1孔道關(guān)鍵氨基酸W366(等同于Shaker的W435)和Y376發(fā)生突變后,外向鉀電流消失,說明通道突變后失活.類似于Shaker的突變型通道W434F,Kv2.1失活后也能記錄到電壓敏感性的內(nèi)向鈉電流,與之不同的是該內(nèi)向鈉電流是在生理條件(內(nèi)液中有K+)下記錄到的.Y376F對Kv2.1通道的影響與W366位點突變后的現(xiàn)象相同.通道關(guān)鍵位點突變后的現(xiàn)象在Kv2.1和Kv2.2中具有普遍性.這說明W366和Y376以及W374和Y384之間的氫鍵對哺乳動物電壓門控鉀離子通道的失活和離子選擇性的調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用.

前人研究表明電壓門控鉀離子通道的C-type失活在結(jié)構(gòu)上與靠近胞外側(cè)選擇性濾器的結(jié)構(gòu)相關(guān)(見前言部分),有研究發(fā)現(xiàn)通道外孔和孔螺旋區(qū)域的氨基酸殘基的相互作用對C-type失活過程中選擇性濾器功能的維持起關(guān)鍵作用[45-46],另外,孔螺旋區(qū)域的氨基酸殘基也可以和選擇性濾器結(jié)構(gòu)相互作用,影響孔道的慢失活[42,45].同時,研究發(fā)現(xiàn)電壓門控鉀離子通道Shaker和Kv2.1在C-type失活過程中表現(xiàn)為對鉀離子的通透性變?nèi)?對鈉離子的通透性變強[47-48],與本研究的實驗現(xiàn)象相似,Shaker的突變型通道W434,在非生理條件下發(fā)生永久失活及通道離子選擇性的顯著變化[42],本研究中通道的失活及離子選擇性因關(guān)鍵位點氨基酸突變也發(fā)生顯著改變,我們推測在哺乳動物大鼠Kv中,決定C-type失活和通道離子選擇性的結(jié)構(gòu)在位置上靠近,功能上相偶聯(lián),具體的機理有待于進一步的探索.

本研究中關(guān)鍵位點氨基酸的突變很可能會引起選擇性過濾器結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和構(gòu)象的變化.已有研究發(fā)現(xiàn),在Kv通道C-type失活過程中選擇性濾器及其胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化會影響離子的通透[46],鏈霉菌鉀離子通道KcsA選擇性濾器結(jié)構(gòu)的變化也會影響離子的通透[49-50].Kv2.1和Kv2.2孔道區(qū)域關(guān)鍵位點氨基酸的突變使原有氫鍵破壞，很可能降低孔道區(qū)域結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或構(gòu)象改變，使通道傾向于通透半徑較小的離子.結(jié)構(gòu)方面微觀層次的變化有待于進一步研究.