,*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617;2.天津嘉氏堂科技有限公司,天津 300193;3.長春海關(guān)(原吉林檢驗(yàn)檢疫局),吉林長春 130012)

萬古霉素和去甲萬古霉素均屬于三環(huán)糖肽類抗生素[1],含有多個氨基酸和堿性的伯氨基團(tuán),呈弱堿性[2]。萬古霉素和去甲萬古霉素是革蘭氏陽性球菌的天敵,對絕大多數(shù)革蘭陽性菌有很好的體外抗菌活性[3],在臨床上通常被用作經(jīng)β-內(nèi)酰胺類抗生素或其它抗菌藥物治療失敗后最后才使用的藥物,即用于治療對其他抗生素不敏感的革蘭氏陽性菌所引起的嚴(yán)重致命性感染,故常被認(rèn)為是“最后一線”藥物[4]。

隨著動物性食品需求的急劇增長,抗生素類藥物的不合理使用、濫用以及不遵守休藥期等多種原因所導(dǎo)致的食品安全問題越來越多。研究表明,長期攝入低劑量萬古霉素類藥物殘留的產(chǎn)品,會導(dǎo)致藥物在人體內(nèi)緩慢蓄積,從而引起器官功能紊亂,影響公眾健康[5]。因此,動物源食品中萬古毒素類藥物殘留的控制也越來越受到關(guān)注。萬古毒素被農(nóng)業(yè)部第560號公告規(guī)定為禁用獸藥[6],也被列入衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第1～5批匯總)》[7]。

抗生素廣泛用于養(yǎng)殖業(yè),具有促進(jìn)其生長、抗菌和抗蟲害等方面作用,在雞肉和雞蛋調(diào)查研究中均有發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、磺胺等抗生素,嚴(yán)重影響人體健康和進(jìn)出口貿(mào)易[8-9]。目前萬古霉素和去甲萬古霉素的測定對象主要集中在血液[10]、腦脊液[11]研究上,其他基質(zhì)較多的是動物源食品[12]、豬肉[13-14]、魚[15]、蝦[16]、飼料[17]、乳制品[18]等,雞蛋中的研究未見報(bào)道。雞蛋屬于動物源食品,基質(zhì)比較復(fù)雜,蛋白質(zhì)、脂肪等含量較高,基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重,需要進(jìn)一步凈化。動物源食品常用的凈化方法有固相萃取技術(shù)(SPE)、基質(zhì)固相分散提取技術(shù)(MSDP)和凝膠滲透色譜法(GPC)等[19]。SPE操作簡便、快速,對痕量分析具有一定優(yōu)勢。

因此,本文采用SPE凈化方式對雞蛋基質(zhì)進(jìn)行凈化,結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(UPLC-/MS/MS)測定雞蛋中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量,以期為雞蛋中萬古霉素和去甲萬古霉素的質(zhì)量控制提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

API4500超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀 美國AB公司;Milli Q型超純水器 美國Millipore公司;Allegra X-22R型冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司;Vortex-Genie 2型渦旋混勻器 美國Scientific Industries公司;OA-SYS型氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密稱取適量萬古霉素和去甲萬古霉素,加甲醇溶解,并定容于25 mL容量瓶中,作為萬古霉素和去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密移取適量萬古霉素和去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于25 mL容量瓶中,加甲醇定容,稀釋為5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,分裝于進(jìn)樣小瓶中備用。用0.1%甲酸水∶乙腈溶液=95∶5 (V/V)將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成5、10、20、50、100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品提取與凈化 稱取約5 g雞蛋液(精確至0.01 g)于離心管中,加入20 mL 0.1%甲酸水,渦旋混合2 min后以15000 r/min離心10 min,取出5 mL上清液加入Strata-X-C固相萃取柱(使用前用3 mL 2%甲酸甲醇和6 mL 2%甲酸溶液活化),分別用3 mL水和3 mL甲醇以小于1 mL/min的速度淋洗,棄去,用3 mL10%氨水-甲醇溶液以小于1 mL/min的流速洗脫于氮吹管中,于40 ℃下氮吹至近干,用1 mL 0.1%甲酸水∶乙腈溶液=95∶5 (V/V)溶解,過0.22 μm濾膜,供超高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);柱溫:30 ℃;流速0.20 mL/min;進(jìn)樣體積:20.0 μL;流動相A為 0.1%甲酸水溶液和B為乙腈。采用梯度洗脫方式:0～5.00 min,95% A～80% A;5.00～7.00 min,80% A～5% A;7.00～9.00 min,5% A;9.00～9.01 min,5% A～95% A。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧電離(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);離子源溫度(TEM):550 ℃;電噴霧電壓:5500 V;使用氣體:氮?dú)?純度≥99.99%;氣簾氣(CUR):206.85 kPa;霧化氣(GS1):206.85 kPa;輔助氣(GS2):206.85 kPa;碰撞氣(CAD):41.37 kPa。母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國AB公司)處理數(shù)據(jù),以萬古霉素或去甲萬古霉素的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),采用外標(biāo)曲線法進(jìn)行回歸分析。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對雞蛋液中萬古霉素和去甲萬古霉素的含量,計(jì)算公式如下。

內(nèi)部控制對于醫(yī)院的意義更多的是為了能夠落實(shí)控制目標(biāo)，通過一系列的內(nèi)部控制流程將經(jīng)濟(jì)活動的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行遏制。而且醫(yī)院作為市場經(jīng)濟(jì)中特殊的組織，內(nèi)部控制的主要目的就是為了提升醫(yī)療質(zhì)量，內(nèi)部控制將會計(jì)信息質(zhì)量進(jìn)行提升，為資產(chǎn)安全提供保障。從而確保醫(yī)院的各項(xiàng)業(yè)務(wù)能夠在遵循法律法規(guī)的前提下進(jìn)行落實(shí)，綜述就是醫(yī)院的內(nèi)部控制是否具有高效的運(yùn)營直接關(guān)系到醫(yī)院運(yùn)營管理好壞。

表1 萬古霉素和去甲萬古霉素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectra parameters of vancomycin and norvancomycin

注:*為定量離子。

式中,Xi為雞蛋液中萬古霉素或去甲萬古霉素的含量,μg/kg;ci為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到雞蛋液中萬古霉素或去甲萬古霉素的濃度,ng/mL;V為雞蛋液最終定容體積,mL;m為最終雞蛋液代表的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 萬古霉素、去甲萬古霉素為水溶性,微溶于甲醇,幾乎不溶于乙醇或丙酮,在pH3～5的酸性環(huán)境中穩(wěn)定。以0.2%三氯乙酸溶液、0.1%甲酸水和0.1%甲酸水溶液∶乙腈=5∶5(V/V)[18]為提取溶劑,向5 g雞蛋液中加入100 μL 5 mg/L的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,按照1.2.2項(xiàng)下,取5 mL上清液加入預(yù)活化的Strata-X-C固相萃取柱。圖1為不同提取溶劑的回收率結(jié)果。由圖1可知,以0.2%三氯乙酸溶液為提取溶劑時,萬古霉素和去甲萬古霉素平均回收率較低,可能是因?yàn)槿纫宜崴嵝暂^強(qiáng),影響了Strata-X-C固相萃取柱的上柱效果。以0.1%甲酸水和0.1%甲酸水溶液∶乙腈=5∶5 (V/V)為提取溶劑時,萬古霉素和去甲萬古霉素平均回收率均大于90%,符合GB/T 27404-2008附錄中回收率在60%～120%之間的要求。因此,從環(huán)保和經(jīng)濟(jì)角度來考慮,最終選定0.1%甲酸水為提取溶劑。

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素在不同提取溶劑下的回收率Fig.1 Recovery rate of vancomycin and norvancomycin with different extraction solvents

2.1.2 凈化方法的選擇 以0.1%甲酸水為提取溶液,向5 g雞蛋液中加入100 μL 5 mg/L的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,按1.2.2項(xiàng)下,取5 mL上清液加入預(yù)活化的PCX[16]、MCX、Strata-X-C[12]、SCX、MCT陽離子交換柱和HLB固相萃取柱。由圖2可知,使用Strata-X-C固相萃取柱時,萬古霉素和去甲萬古霉平均回收率均大于90%,而PCX、MCX、SCX、MCT陽離子交換柱和HLB固相萃取柱的平均回收率均低于90%。分析原因可能是其填料比較致密,離子交換效率較高,回收率較好。因此最終選定Strata-X-C固相萃取柱。

圖2 萬古霉素和去甲萬古霉素在不同固相萃取柱下的回收率Fig.2 Recovery rate of vancomycin and norvancomycin with different solid phase extraction columns

2.1.3 Strata-X-C固相萃取柱洗脫液體積的選擇 本方法對Strata-X-C固相萃取柱進(jìn)行了淋洗曲線試驗(yàn)。以0.1%甲酸水為提取溶液,向5 g雞蛋液中加入100 μL 5 mg/L的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,按1.2.2項(xiàng)下條件通過Strata-X-C固相萃取柱,收集每1 mL洗脫液于單個試管中,共收集8 mL,并分別測定各段洗脫液中萬古霉素和去甲萬古霉素的含量,以確定Strata-X-C固相萃取柱凈化的洗脫收集體積。由圖3可知,3 mL洗脫液時萬古霉素和去甲萬古霉素回收率基本趨于穩(wěn)定。因此,本方法確定收集3 mL洗脫液可以將萬古霉素和去甲萬古霉素全部洗脫下來。

圖3 10%醇氨水-甲醇洗脫的淋洗曲線Fig.3 Leaching curve eluted of 10% alcohol ammonia-methanol solution

2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 本方法考查了不同色譜柱Agilent Zorbax SB C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)、Aglient XDB C18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);Waters Xbridge C18柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,三種色譜柱均可以得到較好的峰形,Aglient XDB C18峰形稍微差一些,分離度和靈敏度也稍差。但總體來說,Waters Xbridge C18柱和Agilent Zorbax SB C18柱均可以使萬古霉素和去甲萬古霉素得到基線分離,但Agilent Zorbax SB C18靈敏度較高,故選擇Agilent Zorbax SB C18作為色譜柱。

圖4 萬古霉素和去甲萬古霉素不同色譜柱的色譜圖Fig.3 Chromatogram of different columns of vancomycin and norvancomycin注:A:Agilent Zorbax SB C18色譜柱;B:Aglient XDB C18色譜柱;C:Waters Xbridge C18色譜柱;1:去甲萬古霉素;2:萬古霉素。

2.2.2 流動相的優(yōu)化 在流動相中加入適量甲酸,可以在萬古霉素、去甲萬古霉素離子化過程中提供質(zhì)子,提高其離子化效率,從而增加其響應(yīng)強(qiáng)度,但甲酸含量太高也會抑制其離子化,從而降低響應(yīng)強(qiáng)度。本方法嘗試水相中添加乙酸銨,但萬古霉素和去甲萬古霉素均不出峰,表明乙酸銨對電離產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。因此,本方法采用0.1%甲酸水溶液作為水相,有機(jī)相考查了甲醇和乙腈,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,選用乙腈時萬古霉素、去甲萬古霉素分離度更高,峰形對稱性更好,因此最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相體系。

圖5 萬古霉素和去甲萬古霉素不同有機(jī)相的色譜圖Fig.5 Chromatogram of different organic phases of vancomycin and norvancomycin注:A:甲醇;B:乙腈;1:去甲萬古霉素;2:萬古霉素。

2.2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 一般質(zhì)譜條件優(yōu)化采用1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動泵直接進(jìn)質(zhì)譜進(jìn)行分析。但本方法嘗試用1.0 μg/mL的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣,在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,發(fā)現(xiàn)725.0和718.2的分子離子峰,但靈敏度很低,以至于無法進(jìn)行子離子掃描。于是,嘗試用更大濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行直接進(jìn)樣,直到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為20.0 μg/mL時,母離子全掃描和子離子掃描時峰比較明顯。萬古霉素和去甲萬古霉素屬多肽類抗生素,是由氨基酸縮合而成的肽類物質(zhì),分子量分別為1449.2、1434.2,容易形成[M+2H]2+分子離子。由圖6可知,母離子全掃描時,m/z 725.3、718.2豐度較大,未發(fā)現(xiàn)[M+H]+分子離子峰。因此,選擇m/z 725.3、718.2分別作為萬古霉素和去甲萬古霉素的母離子。通過碎片離子掃描(Product Ion MS2)模式對萬古霉素施加不同碰撞能量進(jìn)行掃描,由圖7可知,萬古霉素母離子m/z 725.3 產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 144.1和m/z 1306.0子離子,將m/z 141.1作為定量離子。由圖8可知,去甲萬古霉素母離子m/z 718.2產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 144.0和m/z 1292.3子離子,將m/z 144.0作為定量離子。最后以MRM模式優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。

圖7 萬古霉素的碎片離子掃描譜圖Fig.7 Fragment ion scanning spectra of vancomycin

圖8 去甲萬古霉素的碎片離子掃描譜圖Fig.8 Fragment ion scaning spectra of norvancomycin

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析中,離子化是重要的一步。離子化過程中,常因?yàn)殡s質(zhì)的干擾而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),會干擾目標(biāo)化合物的離子化。稱取兩份陰性樣品,以0.1%甲酸水為提取溶液,一份添加50.0 μg/kg萬古霉素、去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.2項(xiàng)下方法,Strata-X-C固相萃取柱凈化,接取3 mL洗脫液。由圖9可知,本方法經(jīng)凈化后,基本無基質(zhì)效應(yīng),因此用標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線即可進(jìn)行校正,減輕了檢測人員的工作量,節(jié)省試劑和材料。

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量限 按1.2.3項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件測定5、10、20、50、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到相應(yīng)的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。萬古霉素和去甲萬古霉素在5.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性方程分別為Y=2270X+3270和Y=3270X+52.6,線性相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9995和0.9994。

向陰性樣品中加入適量萬古霉素和去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品,以0.1%甲酸水為提取溶液,按照1.2.2項(xiàng)下方法,Strata-X-C固相萃取柱凈化,接取3 mL洗脫液,在按1.2.3項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件測定。以信噪比S/N=3計(jì)算萬古霉素和去甲萬古霉素的檢出限均為2.0 μg/kg,以信噪比S/N=10計(jì)算定量限均為5.0 μg/kg。

2.3.3 回收率與精密度 回收率采用陰性樣品,以0.1%甲酸水為提取溶液,分別添加5.0、10.0和50.0 μg/kg三個水平的萬古霉素、去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.2項(xiàng)下方法,Strata-X-C固相萃取柱凈化,接取3 mL洗脫液。每個水平單獨(dú)測定6次,計(jì)算回收率和精密度,結(jié)果見表2。萬古霉素和去甲萬古霉素的平均回收率分別為85.6%～91.5%和88.9%～96.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為5.6%～9.2%和3.7%～9.2%。

2.4 實(shí)際樣品的測定結(jié)果

應(yīng)用本方法對15個雞蛋樣品進(jìn)行了分析測定,其中萬古霉素和去甲萬古霉素均未檢出,說明作為“最后一線”藥物,萬古霉素和去甲萬古霉素在畜禽養(yǎng)殖使用上控制得較好。

3 結(jié)論

本文建立了SPE結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定雞蛋中的萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量的方法。本方法以0.1%甲酸水為提取溶劑,選擇Strata-X-C固相萃取柱凈化,基本無基質(zhì)效應(yīng)。同時,萬古霉素和去甲萬古霉素在5.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,檢出限均為2.0 μg/kg,定量限均為5.0 μg/kg,萬古霉素和去甲萬古霉素的平均回收率分別為85.6%～91.5%和88.9%～96.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為5.6%～9.2%和3.7%～9.2%,符合技術(shù)要求。本方法具有選擇性好、操作簡單、靈敏度高、回收率穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),適用于雞蛋中萬古霉素和去甲萬古霉素的測定。