,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆庫爾勒市畜牧獸醫(yī)站,新疆庫爾勒市 841000)

沙門菌是一種能嚴(yán)重威脅到人類健康的食源性致病菌之一,人如果食用了被一定濃度沙門菌污染的食物會(huì)引起中毒,導(dǎo)致傷寒、腸熱癥、敗血癥、胃腸炎等疾病[1]。根據(jù)美國(guó)疾病控中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2-3],每年在美國(guó)由沙門菌引發(fā)的食源性疾病常常居于食源性疾病的前列,從2006年到2017年,沙門菌占所有食源性疾病爆發(fā)的53.4%,自2008年以來,歐洲確診感染沙門菌病病例呈逐漸下降的趨勢(shì),但腸炎沙門菌感染的比例在不斷增加。在中國(guó),每年由沙門菌造成的食物中毒事件層出不窮,因此建立有效、快速的檢驗(yàn)方法對(duì)于預(yù)防和控制沙門菌病十分重要。

目前,沙門菌的檢測(cè)方法較多,比較傳統(tǒng)的是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)沙門菌,其中分子生物學(xué)、免疫學(xué)等方法的發(fā)展大大提高了沙門菌檢測(cè)靈敏度,縮短了檢測(cè)時(shí)間,簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序[4],但對(duì)操作人員以及環(huán)境要求較高,血清易產(chǎn)生交叉反應(yīng)而造成假陽性或假陰性,在檢測(cè)時(shí)間上不能適應(yīng)疫情發(fā)生時(shí)的快速檢測(cè)。近年來,隨著畜禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及動(dòng)物性食品的增多,沙門菌的快速檢測(cè)也隨之重要起來。微流紙基分析裝置(microfluidic paper-based analytical devices,μPADs)技術(shù)利用酶-底物法來減少操作步驟,縮短檢測(cè)時(shí)間。前期研究得到E.coli+S.en-μPADs快速檢測(cè)裝置并申請(qǐng)專利[5]。沙門菌微流紙基分析裝置(Salmonellamicrofluidic paper-based analytical devices SE-μPADs)能滿足上述快速檢測(cè)的要求,但效果還有待評(píng)價(jià),本實(shí)驗(yàn)分別用SE-μPADs快速檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)庫爾勒市某市場(chǎng)及屠宰場(chǎng)中的不同動(dòng)物源(雞、牛、羊)的胴體拭子、肛拭子、操作工具、肉樣進(jìn)行沙門菌的檢測(cè),為SE-μPADs快速檢測(cè)試紙的推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB)、蛋白胨緩沖液(buffered peptone water,BPW)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate,XLD)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine,SC)、亞硫酸鉍培養(yǎng)基(bismuth sulfite,BS)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(tatrathionate broth,TTB) 青島海博生物技術(shù)有限公司;沙門菌顯色培養(yǎng)基 法國(guó)科瑪嘉;TAE 北京鼎國(guó)昌盛有限公司;Taq MasterMix、DNA Marker Takara;標(biāo)準(zhǔn)腸炎沙門菌CVCC 3762菌株 中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;2-Naphthyl caprylate J&K Scientific bvba公司;無水乙醇 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;SE-μPADs快速檢測(cè)試紙(已申請(qǐng)專利[6]) 本實(shí)驗(yàn)室制備。

LDZX-50 KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2FD博迅凈化工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BCD-219D冰箱 青島海爾股份有限公司;PL203電子天平 梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司;ST-98AB多功能振蕩器 北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所;DYCP-31 DN水平電泳槽、DYCP-31 DN穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;GELDOCXR+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司;Canon LIDE220掃描儀 佳能公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在庫爾勒市某市場(chǎng)及定點(diǎn)屠宰場(chǎng)采集樣本共380份,其中牛羊肉各41份,牛胴體拭子54份、羊胴體拭子67份,操作工具10份,羊肛拭子15份,雞肛拭子152份,采樣方法參照GB 4789.1-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則[7]。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法樣品處理 按照GB 4789.4-2016[7]進(jìn)行處理。

1.2.2.2 SE-μPADs快速檢測(cè)方法的樣品處理 肉樣的處理:無菌稱取5 g新鮮肉樣并剪碎,置于盛有45 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的錐形瓶中,順時(shí)針搖勻,時(shí)間為1～2 min,取1 mL的樣品處理液加入9 mL的BPW中,進(jìn)行密封并放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)15 h。胴體及操作工具拭子的處理:將采集胴體及操作工具后的拭子進(jìn)行前增菌處理,取1 mL的樣品處理液加入9 mL的BPW中置于37 ℃恒溫?fù)u床上,以160～180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)15 h。

1.2.3 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)沙門菌 將處理好的樣品分別加入SC與TTB增菌液,并置于37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)18～24 h,再分別接種至XLD、BS瓊脂選擇性培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)24、48 h。將疑似菌株接至沙門菌顯色培養(yǎng)基并用水煮法[8]提取菌落DNA,對(duì)invA基因和16S rRNA基因進(jìn)行PCR鑒定,引物序列表如表1所示,并將陽性產(chǎn)物送測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫與BLAST中的結(jié)果比對(duì)。invA基因PCR的反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min,35個(gè)循環(huán)。25 μL的反應(yīng)體系包括10 μL Mix;上下游引物各0.5 μL,模板1 μL,dd·H2O 13 μL。PCR反應(yīng)體系中陰性對(duì)照的模板為1 μL的dd·H2O外;陽性對(duì)照的模板為沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA。

表1 沙門菌引物序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 Salmonella primer sequences and amplification length

1.2.4 SE-μPADs檢測(cè)方法 將處理好的樣品取1 mL加入盛有5 mL BPW的離心管中,置于37 ℃恒溫?fù)u床上,以180～200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5 h。將富集5 h的菌液滴加至SE-μPADs的點(diǎn)樣區(qū)(SE-μPADs為三聯(lián)試紙,紙片中央為點(diǎn)樣區(qū),左右兩側(cè)為加底物的顯色區(qū)),再將SE-μPADs快速檢測(cè)試紙放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)1.5 h。每組試驗(yàn)均設(shè)計(jì)空白對(duì)照,空白對(duì)照即為不加菌液的BPW。同時(shí)每組均設(shè)兩個(gè)重復(fù)。滴加沙門菌底物的區(qū)域滴加固藍(lán)B鹽進(jìn)行顯色反應(yīng),反應(yīng)完成后,觀察SE-μPADs顯色情況,若試紙左右兩側(cè)顯色區(qū)域與陽性對(duì)照一致,顯示紫色,則可判斷為疑似陽性,若顯色區(qū)域的顏色未出現(xiàn)紫色(與空白對(duì)照組一致為淡粉色)則可初步判定為陰性,并且對(duì)SE-μPADs區(qū)域用掃描儀進(jìn)行掃描,用軟件ImageJ 1.4u讀取SE-μPADs快速檢測(cè)試紙的灰度值。最終結(jié)果判定:若顯色區(qū)域的灰度值大于空白對(duì)照組的灰度值,則代表檢測(cè)結(jié)果為檢出沙門菌;若顯色區(qū)域的灰度值小于等于空白對(duì)照,則代表未檢出沙門菌。SE-μPADs檢測(cè)出的疑似沙門菌繼續(xù)進(jìn)行PCR驗(yàn)證invA基因與16S rRNA基因,同1.2.4。

表3 SE-μPADs檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of SE-μPADs

1.2.5 SE-μPADs陽性符合率(靈敏度)、陰性符合率(特異性)的計(jì)算 計(jì)算兩種方法的陽性符合率、檢測(cè)方法的陽性符合率(靈敏度)及陰性符合率(特異性)是按照衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)[9-10]公式進(jìn)行計(jì)算(表2)。

表2 兩種檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison of two detection methods

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Office 2010 EXCLE軟件進(jìn)行匯總與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.4-2016,對(duì)380份樣品進(jìn)行選擇性增菌,然后接至XLD與BS兩種選擇培養(yǎng)基上,選擇帶有典型菌落的共76株菌,接至顯色培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證,如圖1,出現(xiàn)紫色菌落的樣品有15株。挑取紫色菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2),有6株為沙門菌,在羊肉中檢出2株,分別在羊胴體、牛胴體、雞肛拭子、操作工具中各檢出1株。

圖1 沙門菌在顯色培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Morphology of Salmonella on chromogenic

圖2 沙門菌invA的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection of Salmonella invA by PCR注:1:DL2000 DNA Marker;2:陽性對(duì)照;3:陰性對(duì)照;4～5:肉樣;6:雞肛拭子;7:羊胴體拭子;8:牛胴體拭子;9:操作工具拭子。

2.2 SE-μPADs快速檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果

由表3可知,經(jīng)SE-μPADs法檢測(cè)380份樣品后,有25株菌顏色灰度值大于空白對(duì)照組的顏色灰度值(圖3),對(duì)25株菌按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行驗(yàn)證,接種于顯色培養(yǎng)基上并進(jìn)行PCR鑒定(圖4),結(jié)果檢測(cè)出10株沙門菌,其中肉樣3株、牛胴體拭子3株、羊胴體拭子1株、操作工具1株、雞肛拭子2株,陽性率為2.63%。

圖3 部分SE-μPADs快速檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Rapid detection results of partial SE-μPADs 注:紙片中間為點(diǎn)樣區(qū),左右兩側(cè)圓形為顯色區(qū);1:陽性對(duì)照;2:空白對(duì)照;3:雞肛拭子;4:胴體拭子。

圖4 SE-μPADs篩出的沙門菌PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection of Salmonella invA by PCR of SE-μPADs screening注:1:DL2000 DNA Marker;2:陽性對(duì)照;3:陰性對(duì)照;4～7:樣品。

2.3 SE-μPADs快速檢測(cè)法檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

分別根據(jù)SE-μPADs檢測(cè)方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果,SE-μPADs方法的初篩率為6.58%(25/380),而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法初篩率為20%(76/380),SE-μPADs方法較國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法初篩率低。SE-μPADs檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法具體檢測(cè)結(jié)果見表4,根據(jù)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算表格中SE-μPADs的陰性符合率(特異性)94.92%、陽性符合率(靈敏度)為100%。

表4 SE-μPADs和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較Table 4 Comparison of the SE-μPADs and the national standard methods

2.4 庫爾勒市沙門菌的污染情況

同時(shí)應(yīng)用兩種方法對(duì)380份樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,SE-μPADs檢測(cè)方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)出沙門菌10株,由表3可以看出,總檢出率為2.63%,其中肉樣82份,檢出3份,檢出率為3.66%;胴體拭子共121份，檢出4份，胴體拭子檢出率為3.31%(牛胴體拭子54份,檢出3份,檢出率為5.56%;羊胴體拭子67份,檢出1份,檢出率為1.49%);操作工具10份,檢出1份,檢出率為10.00%,雞肛拭子共152份,檢出2份,檢出率為1.31%。

3 結(jié)論與討論

3.1 庫爾勒市沙門菌的污染情況

本次對(duì)庫爾勒市市場(chǎng)及屠宰場(chǎng)內(nèi)的牛羊肉及其胴體表面、加工用具,雞、羊肛拭子中的沙門菌污染情況調(diào)查研究顯示:加工用具、牛羊肉及其胴體表面、雞肛拭子中均存在沙門菌污染的情況,使用兩種方法共檢測(cè)380份受檢樣品,共同篩出沙門菌陽性樣品數(shù)為10份,沙門菌的陽性檢出率為2.63%,可見庫爾勒市屠宰場(chǎng)中肉樣和胴體拭子表面均存在沙門菌的污染。

本次對(duì)庫爾勒市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)中的肉的污染率為3.66%,其胴體拭子3.31%。有研究表明,肉類及肉制品最易受到沙門菌的污染,Niyonzima等[11]檢測(cè)了肉類及其制品,顯示肉中的沙門菌污染率達(dá)到了21.4%。由于沙門菌在環(huán)境中廣泛存在,養(yǎng)殖場(chǎng)及其周圍可通過被污染的土壤及水源傳播,抵抗力較低的畜禽最易受感染,而這些畜禽是市場(chǎng)中肉制品的主要來源,若沒有及時(shí)控制污染源,極易造成污染擴(kuò)散,污染的刀具等加工用具造成健康畜禽肉的二次污染[12]。這提示有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)肉制品的監(jiān)管,防止肉制品中沙門菌引起的食物中毒的爆發(fā)。

3.2 SE-μPADs快速檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果對(duì)比

目前關(guān)于紙基微流控制芯片技術(shù)檢測(cè)沙門菌的相關(guān)報(bào)道較少,Jokerst等[13]利用酶底物法檢測(cè)沙門菌,從增菌到檢出時(shí)間僅需8～12 h,在富集期僅3 h后檢測(cè)到鼠傷寒沙門菌,檢測(cè)到的酯酶量為0.52±0.06 μg/mL。Bisha等[14]用μPAD檢測(cè)農(nóng)業(yè)用水中的沙門菌,從制作裝置到顯色需要24 h。從兩種方法對(duì)沙門菌的檢測(cè)時(shí)間分析,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)沙門菌從初增菌到接種至選擇性培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型菌落需要約3 d,而SE-μPADs快速檢測(cè)試紙完成初篩需要21.5 h,與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較,在初篩的過程中縮短了約2 d,縮短了沙門菌的檢出時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中在兩種方法的初篩過程中SE-μPADs快速檢測(cè)方法從粗增菌到顯色篩出疑似沙門菌的初篩率為6.6%,低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的初篩率20%(從初增菌到選擇性培養(yǎng)基出現(xiàn)典型菌落),進(jìn)一步對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證,PCR方法進(jìn)行鑒定后SE-μPADs快速檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的陽性符合率(靈敏度)為100%,說明SE-μPADs快速檢測(cè)方法能夠完成樣品的初篩工作,但在檢測(cè)過程中SE-μPADs快速檢測(cè)方法的陰性符合率(特異性)為94.92%,說明SE-μPADs快速檢測(cè)試紙還存在假陽性的問題,這提示SE-μPADs快速檢測(cè)試紙還有待進(jìn)一步優(yōu)化,減少假陽性,提高檢測(cè)的特異性。SE-μPADs快速檢測(cè)法具有快速簡(jiǎn)單直觀經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),且試紙的成本更低,而且無需任何特殊熒光儀器設(shè)備,僅需肉眼可觀測(cè)到顏色,結(jié)果更加直觀。該檢測(cè)裝置利用比色的方法檢測(cè)食品中的沙門菌,相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)技術(shù),富集時(shí)間顯著減少,因此SE-μPADs快速檢測(cè)法是一種簡(jiǎn)便、快捷的沙門菌檢測(cè)方法。SE-μPADs檢測(cè)裝置未來發(fā)展的目標(biāo)是通過嘗試使用特異性誘導(dǎo)劑來增強(qiáng)酶的產(chǎn)生,以及利用選擇性富集培養(yǎng)基抑制競(jìng)爭(zhēng)性微生物的生長(zhǎng)來提高檢測(cè)限,縮短檢測(cè)時(shí)間,減少假陽性率的發(fā)生。

4 結(jié)論

SE-μPADs快速檢測(cè)方法能夠完成樣品的初篩,陽性符合率可以達(dá)到100%;庫爾勒市屠宰場(chǎng)及市場(chǎng)均存在沙門菌的污染且肉樣中沙門菌污染率較高,相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)屠宰場(chǎng)及市場(chǎng)中沙門菌的檢測(cè)及監(jiān)管。