,2,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070;2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)

隨著工業(yè)的發(fā)展,人類工業(yè)活動例如電鍍、采礦、冶煉等,導(dǎo)致大量Cd隨廢水排放及地表徑流進(jìn)入水生生態(tài)環(huán)境中,重金屬Cd的污染問題日益嚴(yán)重[1-2]。Cd具有極強(qiáng)的蓄積性和毒性,是生物體非必需的重金屬元素,若被動物攝食,可以通過食物鏈的逐級傳遞和富集,進(jìn)而引起人體各種急性、慢性的毒性作用,最后對人類的健康造成威脅[3-4]。蓄積在動物和人體內(nèi)的Cd會造成生殖系統(tǒng)功能障礙、損害結(jié)締組織和腎、致癌和致畸等,甚至影響兒童的生長和智力發(fā)育,因此,鎘污染已經(jīng)受到越來越多人的關(guān)注[5-6]。

水生生物的多型異源物質(zhì)抗性機(jī)制(Multi-xenobiotic resistance,MXR),是一種通過將內(nèi)源和外源物質(zhì)排出細(xì)胞,從而避免機(jī)體和細(xì)胞傷害的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),類似于哺乳動物的多藥抗性機(jī)制(Multi-drug resistance,MDR)。多種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成MXR,其中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)起到了非常重要的作用。它屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族,是Mdr1基因編碼的跨膜蛋白。P-gp是一類能量依賴性的外排泵,可以通過水解ATP,參與到藥物和內(nèi)、外源毒素的吸收、分布和排泄中,起到防御保護(hù)和解毒的作用[7-8]。有研究表明P-gp在重金屬離子的吸收、積累和排泄中起重要作用,Achard等[9]的研究表明,當(dāng)河蜆暴露于重金屬Cd、Hg、Zn、Cu等時,P-gp的表達(dá)量顯著提高,且其基因表達(dá)量隨鰓組織中重金屬富集濃度的增加而增加,與水體和鰓組織中重金屬濃度呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

鯽魚肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美,具有很高的營養(yǎng)價值,深受廣大消費(fèi)者的喜愛。鯽魚在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中具有非常重要的位置,其對水環(huán)境中物理、化學(xué)和生物因素等變化反應(yīng)十分靈敏,因而在毒理學(xué)和評價生態(tài)風(fēng)險中表現(xiàn)出非常重要的實(shí)用價值[10-11]。本文以鯽魚作為實(shí)驗(yàn)動物,對其鰓組織中Cd的累積情況、P-gp活性以及mRNA表達(dá)的變化進(jìn)行探究,分析P-gp在鯽魚體內(nèi)耐受重金屬Cd機(jī)制中的作用,分析重金屬Cd累積與P-gp活性及其基因表達(dá)的相關(guān)性,旨在為研究魚類對重金屬的耐受和抗性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯽魚 平均體長為(17±2) cm,平均體重為(80±15) g,武漢某淡水魚養(yǎng)殖基地;動物組織/細(xì)胞總RNA快速提取試劑盒、Reverse Transcriptase Kit(M-MLV)、2×HSYBR Green qPCR Mix 北京莊盟國際生物基因科技有限公司;維拉帕米(Verapamil,Ver) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化鎘、高氯酸、硝酸、羅丹明B(Rhodamine B,Rho B)等試劑 均為分析純(AR),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AA240Duo型原子吸收光譜儀 美國安捷倫科技公司;F200 INFINITE型多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯Tecan公司;Qtower 2.2熒光定量PCR儀 德國耶拿公司;TCL-16高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥與取樣 鯽魚放于600 L的玻璃水箱內(nèi)養(yǎng)殖,養(yǎng)殖用水為充分曝氣的除氯后的自來水,在實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)一周,以使它們適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件,整個養(yǎng)殖過程中增氧機(jī)連續(xù)充氧,采用半靜態(tài)飼養(yǎng)法,用水pH(7.0±0.5),溫度(23±1) ℃,溶氧量(6.8±0.7) mg/L,水硬度(133.4±2.0) mg/L(以CaCO3計)[12]。采用急性毒性試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為四組,一個對照組和三個實(shí)驗(yàn)組,對照組添加充分曝氣、除氯后的自來水,實(shí)驗(yàn)組Cd2+低、中、高濃度2.12、4.23、8.46 mg/L。每組20尾魚,分別在實(shí)驗(yàn)的0、24、48、72和96 h時,從各水箱中取出3尾鯽魚,稱重,測體長,取出鰓組織,用0.1 mol/L pH=7.4的磷酸緩沖液(PBS)沖洗后過濾稱重,分別裝入到1.5 mL塑料離心管中,作好標(biāo)記后快速放入-80 ℃的超低溫冰箱,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鯽魚鰓組織重金屬Cd含量測定 采用國標(biāo)GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測定》方法進(jìn)行測定,具體稱取樣品1.00 g于錐形瓶中,加入9 mL硝酸和1 mL高氯酸浸泡過夜,在電熱板上消化,變成棕黑色后,再加入硝酸消化至透明。冷卻后將消化液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中,采用火焰原子吸收分光光度法測定Cd含量,測定參數(shù)為波長為228.8 nm,燈電流4 mA,燃燒器高度為6.5 mm,以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/L Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)測出標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.2241x+0.0011,決定系數(shù)R2=0.9997。

1.2.3 鯽魚鰓組織中P-gp活性測定 以熒光染料Rho B作為底物,采用排出法測定P-gp活性。此外,使用66.7 μmol/L Ver作為抑制劑[13]。稱取鰓組織100～140 mg放于8 mL濃度為5 μmol/L Rho B的除氯自來水中于黑暗條件下富集30 min。而后將鰓組織轉(zhuǎn)移到等量除氯自來水中,沖洗三次,放回?zé)?加入8 mL除氯自來水預(yù)脫除10 min。預(yù)脫除后,各個鰓組織等分為2個平行樣分別加入到10 mL除氯自來水:一組添加66.7 μmol/L Ver;另一組不添加抑制劑。輕輕震蕩,每隔10 min各取200 μL反應(yīng)液于96孔黑色酶標(biāo)板內(nèi),第60 min取最后一次,多功能酶標(biāo)儀測其熒光值,其中激發(fā)波長為535 nm,發(fā)射光波長為590 nm。根據(jù)測出的熒光值,以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 pmol/L Rho B標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo),熒光值為縱坐標(biāo)測出標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=121.09x+4734.9,決定系數(shù)R2=0.994,計算排除速率(pmol RhoB min-1g-1)[14-16]。

1.2.4 熒光定量PCR

1.2.4.1 引物設(shè)計 目的基因P-gp和內(nèi)參基因GAPDH 的部分DNA 序列分別根據(jù)GenBank中發(fā)表的異育銀鯽和鯉魚的相應(yīng)保守序列[17],采用Primer 5.0自行進(jìn)行設(shè)計的引物,由武漢谷歌生物科技有限公司合成(見表1)。

1.2.4.2 鯽魚鰓組織中總mRNA的提取 總mRNA的提取按照Animal tissue/Cell Total Kit進(jìn)行,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,根據(jù)測定吸光度A260和A280的比值(數(shù)值應(yīng)在1.8～2.1)檢測RNA的純度和濃度。

1.2.4.3 逆轉(zhuǎn)錄 以20 μL反應(yīng)體系合成cDNA,按照Reverse Transcriptase Kit操作。逆轉(zhuǎn)錄后將得到cDNA置于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.4.4 20 μL的PCR反應(yīng)體系 加入2×SYBP qPCR Mix 10 μL;DNA Template 0.5 μL;Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL;Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL;ddH2O 8.7 μL。

1.2.4.5 P-gp熒光定量PCR反應(yīng)條件 95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s共40個循環(huán),在58～95 ℃之間制作熔解曲線;72 ℃再延伸10 min[18-19]。

1.2.4.6 相對定量的計算方法 進(jìn)行相對定量時,檢測樣本中的特定mRNA時,需要以參比樣本為基礎(chǔ),定量測定結(jié)果由靶mRNA/內(nèi)參mRNA 的比值來表示,采用比較閾值法(2-ΔΔCt法)進(jìn)行相對定量。以對照組設(shè)置為1,得到目的基因的相對表達(dá)量[20-21]。

相對表達(dá)量(relative quantification)=2-ΔΔCt=2-[(實(shí)驗(yàn)組P-gp Ct-實(shí)驗(yàn)組GAPDH Ct)-(對照組P-gpCt-對照組GAPDH Ct)]

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個處理重復(fù)三次,采用SPASS 19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚鰓組織中Cd蓄積量的變化

分別測定了不同Cd濃度2.12、4.23、8.46 mg/L和不同暴露時間24、48、72和96 h下鯽魚鰓組織中Cd的含量,結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,鯽魚對Cd有非常強(qiáng)的富集能力,且能在鰓內(nèi)快速富集,這一結(jié)果與之前學(xué)者研究結(jié)果相似[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)不同Cd濃度和時間處理均對Cd在鯽魚鰓組織中的蓄積有顯著的影響(P<0.05)。暴露于4.23和8.46 mg/L Cd后,96 h內(nèi),Cd的含量隨時間的延長呈上升趨勢,說明過高含量的Cd已經(jīng)影響了鯽魚自身的防御機(jī)制,機(jī)體對Cd的攝入量遠(yuǎn)高于排除量,造成Cd的不斷蓄積。暴露于2.12 mg/L Cd后,Cd的含量在48 h達(dá)到最大值,之后有所降低,說明在48 h后,鯽魚體內(nèi)的自身防御解毒機(jī)制起到了非常重要的作用,使Cd的含量不會大幅度增長[15]。且在整個試驗(yàn)期間,鯽魚生長狀態(tài)良好。綜上所述,鯽魚對Cd有一定的耐受能力,并且在耐受范圍內(nèi)能將Cd排出體外。此外,鯽魚對不同重金屬的敏感性、累積能力和排出情況不同,楊麗華[23]研究發(fā)現(xiàn)在4種重金屬Cu、Zn、Cd和Cr中,Cu對鯽魚的致死毒性最大,毒性大小依次為:Cu>Cd>Zn>Cr。

圖1 不同Cd濃度和時間處理下鯽魚鰓內(nèi)Cd富集量Fig.1 Accumulation of Cd in gills of Carassius auratus at different concentrations of Cd and time注:不同字母代表同一時間差異顯著(P<0.05)。圖2～圖4同。

2.2 暴露于Cd后對鯽魚鰓組織P-gp活性變化

排出法測定P-gp活性時,其活性越高,在一定時間內(nèi)排出的Rho B也越多,因此P-gp的活性變化用Rho B排除速率來間接衡量。在P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性測定中,由圖2可以看出,不同Cd濃度處理和不同Cd時間處理均對鯽魚鰓組織P-gp活性變化有明顯影響,這一結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似。Ivanina等[13]在研究重金屬Cd對美洲牡蠣鰓組織中P-gp活性時發(fā)現(xiàn),牡蠣暴露于50 μg/L的Cd,在30～40 d后,Rho B的排除速率是對照組的3.5倍以上。本試驗(yàn)在24 h時,對照組和暴露于2.12 mg/L Cd,Rho B排出速率接近,是由于Cd處理時間短和Cd暴露濃度較低,鯽魚鰓內(nèi)Cd含量低,其P-gp的活性也低。72 h時,不同Cd濃度處理Rho B排出速率均達(dá)到最大,分別達(dá)到了Cd處理前的2.27、2.62、2.77倍,P-gp活性顯著升高(P<0.05),表明鯽魚暴露于Cd后,能提高鰓中P-gp活性,增強(qiáng)體內(nèi)對Cd的排出能力,減少Cd的累積[24],繼而說明P-gp對于鯽魚耐受Cd發(fā)揮著重要的作用。96 h時,P-gp活性下降趨于穩(wěn)定,表明長時間暴露于Cd之后,已經(jīng)影響了鯽魚自身的生理機(jī)能,導(dǎo)致P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低。

圖2 不同Cd濃度和時間處理下鯽魚鰓內(nèi)P-gp活性的變化Fig.2 Changes of P-gp activity in gill ofCarassius auratus at different concentrations of Cd and time

2.3 P-gp抑制劑Ver對鯽魚鰓組織P-gp活性的影響

圖3 暴露于Cd后添加Ver對鯽魚鰓組織P-gp活性的影響Fig.3 P-gp activity in gill of Carassius auratus after exposed to Cd with Ver

當(dāng)向體外鯽魚鰓組織加入終濃度66.7 μmol/L的P-gp抑制劑Ver后,其結(jié)果見圖3,鯽魚鰓組織中P-gp的活性顯著低于未加抑制劑的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),使得Rho B排除速率下降。劉望鵬[14]研究P-gp在近江牡蠣耐受腹瀉性貝毒DSP時發(fā)現(xiàn),在加入P-gp抑制劑環(huán)孢菌素A和Ver后,其鰓組織中P-gp的活性顯著低于未加抑制劑的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。本研究以Cd處理濃度2.12、4.23和8.46 mg/L暴露24 h為例,在加入Ver后,鰓對Rho B的排出速率由不加Ver的 76.15、135.88和149.90 pmol Rho B min-1·g-1分別降低為57.44、90.021和72.64 pmol Rho B min-1·g-1,分別降低了24%、33%和51%,統(tǒng)計學(xué)分析兩者之間差異顯著(P<0.05),表明Ver能有效抑制鯽魚鰓組織中P-gp的活性。因?yàn)镻-gp是依賴于的ATP的外排泵,Ver能競爭性地與P-gp結(jié)合,抑制與P-gp偶聯(lián)的ATPas活性,從而使得Rho B排除速率降低[25],表明P-gp在MXR中發(fā)揮著非常重要的作用,進(jìn)一步反映出MXR鯽魚在耐受Cd中所發(fā)揮的作用。

2.4 暴露于Cd后對鯽魚鰓組織P-gp基因表達(dá)的影響

圖4可以看出,整個實(shí)驗(yàn)過程中,鯽魚鰓組織在暴露于Cd后P-gp的基因表達(dá)明顯上調(diào),且高濃度和中濃度組中P-gp的mRNA表達(dá)量高于低濃度組,這是因?yàn)镻-gp是誘導(dǎo)蛋白。研究表明,自然界中存在的污染因子如毒素、重金屬、馬桑內(nèi)醋等物質(zhì)可以誘導(dǎo)機(jī)體中P-gp蛋白的表達(dá)[26-27]。Ren等[19]研究表明,吡硫鋅可以誘導(dǎo)鯽魚肝臟和腎臟組織中P-gp基因表達(dá)。胡鯤等[28]熒光定量結(jié)果表明,恩諾沙星在低殘留階段,實(shí)驗(yàn)組腸道和肝臟中P-gp的m RNA相對表達(dá)量與對照組無顯著性差異;在高殘留階段,實(shí)驗(yàn)組腸道和肝臟中P-gp的m RNA相對表達(dá)量顯著升高。本實(shí)驗(yàn)表明,不同Cd濃度處理在72 h時,鯽魚鰓組織中P-gp的基因表達(dá)水平均達(dá)到最高,且與對照組有顯著差異(P<0.05),分別達(dá)到對照組的1.54、2.88和3.61倍。隨后,P-gp的基因表達(dá)水平并沒有隨著Cd積累量的增加而繼續(xù)升高,而是出現(xiàn)了較大幅度的降低,這可能是鯽魚對于重金屬Cd存在其他的抗性機(jī)制,也有可能是由于鯽魚長時間處于毒性環(huán)境中破壞其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、影響其正常生理功能,使得P-gp基因表達(dá)水平降低[25]。P-gp基因表達(dá)變化趨勢和活性變化基本相對應(yīng),因此其在mRNA水平的表達(dá)可能在鯽魚耐受重金屬Cd中也發(fā)揮著重要的作用。

圖4 不同Cd濃度和時間處理下鯽魚鰓內(nèi)P-gp基因表達(dá)的變化Fig.4 Changes of P-gp gene expression in gill ofCarassius auratus at different concentrations of Cd and time

3 結(jié)論

本文研究中發(fā)現(xiàn)了鯽魚在暴露于重金屬Cd后,Cd會在鯽魚鰓組織內(nèi)快速累積。同時,鯽魚鰓組織中的P-gp活性和P-gp基因mRNA水平快速提高。P-gp活性的增加可使鯽魚排出Cd的能力增強(qiáng),減少Cd在體內(nèi)的積累,從而減輕外來有害物質(zhì)對機(jī)體的侵害。但Cd處理后在鰓組織中積累量仍在持續(xù)增加,推測P-gp對重金屬Cd可能有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)限度,隨染毒時間的延長,Cd在鰓內(nèi)累積的濃度處于高水平且無法及時排出體外,鯽魚內(nèi)環(huán)境遭受一定的破壞,影響機(jī)體內(nèi)正常的代謝。研究表明,鯽魚鰓組織的P-gp活性和mRNA表達(dá)的變化可較敏感地反映水環(huán)境中重金屬Cd,可作為監(jiān)測水體中重金屬的潛在生物標(biāo)志物。