,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學,吉林長春 130000;2.通化百泉保健食品有限公司,吉林通化 134000)

紅參(Red ginseng)是人參(Panaxginseng)蒸制之后的熟制品,主要功效成分為人參皂苷,具有提高機體免疫力、預(yù)防炎癥、抗氧化、防衰老、抗腫瘤等生物活性[1]。紅景天(Rhodiolarosea)為景天科紅景天屬草本或亞灌木植物,屬傳統(tǒng)藥用植物，有養(yǎng)心、補腎、平喘等功效。紅景天苷為紅景天的主要生物活性成分,在抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等方面具有顯著作用,其藥理作用得到廣泛關(guān)注[2]。大棗(Ziziphusjujuba)含有豐富的蛋白質(zhì)、糖分、礦物質(zhì)和氨基酸等,具有降低膽固醇、抑制癌細胞增殖、養(yǎng)血安神等功效[3]。

隨著社會科技的發(fā)展,激烈的競爭使得人們生活不規(guī)律導(dǎo)致自身機體免疫力下降，食用功能性食品提升免疫力成為了大部分人的選擇。目前以傳統(tǒng)食物和中草藥為載體的提高免疫力的保健產(chǎn)品較為缺乏，所以開發(fā)一款具有提高免疫力功效的保健產(chǎn)品具有很高的意義和價值。

本試驗以紅參為原料,配以紅景天和大棗提升產(chǎn)品功效及口感,研發(fā)一款具有提高免疫力功效的功能性飲品,結(jié)合動物試驗進行產(chǎn)品保健功效的基礎(chǔ)探究，以期為紅參和紅景天的深加工開辟新的產(chǎn)品領(lǐng)域,豐富加工品種,從而促進紅參食品發(fā)展,提高人民健康水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅參、紅景天 百草大藥房;大棗汁(100 mL大棗汁含紅棗原料100 g)、白砂糖 市售;皂苷Re標準品(純度≥98%) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶試劑盒(LDH) 南京建成生物工程研究所;甲醇、香草醛、無水乙醇、硫酸、乙醚、正丁醇、醋酸鉛、硫酸鈉、生理鹽水 均為分析純;雄性昆明小鼠(SPF級18～22 g) 遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(SCXK(遼)2015-0001)。

JY92-II型超聲波細胞破碎儀 杰靈儀器制造(天津)有限公司;BE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責任公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 賽默飛世爾科技有限公司;HX1002T型電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;LXJ-IIB大容量多孔離心機 鹽城凱特試驗儀器公司;354型多功能酶標儀 美國博騰儀器有限公司;D-5L型高壓均質(zhì)機 美國Phd科技公司。

1.2 紅參提取液制備

紅參經(jīng)粉碎機粉碎后過80目篩,稱取5 g紅參粉,加入適當倍數(shù)液料比的水為提取溶劑,在室溫下浸泡2 h后,放入超聲波細胞破碎儀中,按照一定的超聲功率和超聲時間進行提取,提取結(jié)束后4000 r/min離心20 min。將得到的上清液濃縮至1∶1(100 mL提取液含紅參原料100 g)后備用。

1.3 紅景天提取液制備

紅景天經(jīng)粉碎機粉碎后過80目篩子后按液料比40∶1 mL/g,超聲功率300 W,超聲時間30 min的條件進行超聲波提取后將提取液濃縮至1∶1(100 mL提取液含紅景天原料100 g)備用。

1.4 紅參提取液提取工藝優(yōu)化

1.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 參考王玉堂[4]的方法稍作修改,在預(yù)實驗基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken進行優(yōu)化設(shè)計,以人參總皂苷含量為響應(yīng)值,優(yōu)化提取工藝參數(shù)。紅參提取液經(jīng)濃縮(100 mL提取液含紅參原料100 g)后備用。因素水平表如表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factor and level table of response surface test

1.4.2 人參總皂苷含量測定 參照GB/T 19056及陳振[5]的方法稍作修改,以Re為標準品,制作的標準曲線方程為y=3.0478x+0.0097,決定系數(shù)R2為0.9953,線性關(guān)系良好。人參總皂苷含量按公式計算:

式中:X-人參總皂苷含量(%);CONC-通過回歸方程計算出的供試品質(zhì)量(μg);V1-定容體積(mL);V2-取樣體積(μL);m-供試品稱樣量(mg)。

1.5 產(chǎn)品加工工藝

紅參提取液、紅景天提取液、大棗汁、白砂糖→調(diào)配→均質(zhì)→裝瓶密封→殺菌→冷卻→成品

將上述原輔料按一定比例混合后在300 MPa的條件下循環(huán)均質(zhì)2次,于100 mL玻璃瓶灌裝,121 ℃條件下殺菌15 min。

1.6 產(chǎn)品配方最佳參數(shù)優(yōu)化

1.6.1 產(chǎn)品配方響應(yīng)面優(yōu)化 為了確保本產(chǎn)品提高免疫力的功能,并賦予其良好口感,在單因素實驗基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗,以感官品質(zhì)評分為響應(yīng)值,因素水平表如表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factor and level table of response surface test

1.6.2 產(chǎn)品感官評價 根據(jù)林曉琳[6]、Han等[7]的方法稍作修改,隨機選取10名經(jīng)過培訓(xùn)的評定人員組成評定小組,以感官評定標準(表3)進行評價。

表3 感官評價標準(分)Table 3 Criteria for sensory evaluation(score)

1.7 產(chǎn)品提高免疫力試驗

1.7.1 試驗動物分組及計量設(shè)計 按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》方法[8],將48只小鼠隨機分6組:空白組(蒸餾水)、高劑量組(人體推薦量40倍)、中劑量組(人體推薦量20倍)、低劑量組(人體推薦量10倍)、紅參提取液組、紅景天提取液組。紅參-紅景天功能飲品的人體推薦量為每人每天100 mL(衛(wèi)生部規(guī)定每人每天人參攝入量≤3 g,綜合配方優(yōu)化試驗結(jié)果及本產(chǎn)品規(guī)格設(shè)計選擇100 mL/瓶為推薦量)。紅參、紅景天提取液組按產(chǎn)品中劑量40 mL/kg[9]給藥?；A(chǔ)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)7 d,每日灌胃一次,連續(xù)30 d后斷糧給水24 h后頸椎處死,對其臟器指數(shù)(胸腺/體重、脾臟/體重)、細胞免疫功能(遲發(fā)型病態(tài)反應(yīng)試驗-耳腫脹程度)、NK細胞活性(乳酸脫氫酶活性)進行測定。

1.7.2 指標的測定

1.7.2.1 臟器指數(shù) 處死前稱量小鼠體重,解刨取出胸腺及脾臟并稱重,按下列公式計算[10]:

1.7.2.2 細胞免疫功能測定 遲發(fā)型病態(tài)反應(yīng)試驗-耳腫脹程度。灌胃第25 d將每只鼠腹部用脫毛膏脫毛約4 cm×4 cm,用50 μL DNCB溶液均勻涂抹到脫毛處致敏,5 d后用10 μL DNCB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩側(cè),24 h后處死小鼠剪下左右耳殼,用打孔器取下直徑6 mm的圓片并稱重[11],按下列公式計算耳腫脹率:

1.7.2.3 NK細胞活性測定 小鼠眼球取血后立即將血液4000 r/min離心10 min得到血清,并按乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒的測定方法進行測定[12]。乳酸脫氫酶活性按下列公式進行計算:

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取工藝方案設(shè)計及結(jié)果分析

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅參提取液提取工藝試驗設(shè)計見表4,各因素擬合得到回歸方程為:Y=-4.77800+0.053750A-0.087500B-0.041250C+0.38750AB+0.030000AC+0.38250BC-3.23611E-0.11650A2-0.71900B2+0.018500C2?；貧w方程方差分析見表5。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface test

由表5可知,此模型中P<0.01,表示該模型極顯著;失擬項為0.9969>0.05不顯著,表示非試驗因素對此試驗影響不大;R2為0.9922,表明試驗結(jié)果與實際情況擬合度較高。綜上所述,該模型可以用來預(yù)測各試驗條件對人參總皂苷含量的影響。將上述方程求解獲得最佳的理論工藝參數(shù):超聲功率272.13 W,液料比32.29∶1 mL/g,超聲時間32 min。理論預(yù)測值:4.96%。根據(jù)實際情況調(diào)整為超聲功率270 W,液料比32∶1 mL/g,超聲時間32 min。驗證試驗:總皂苷含量4.96%±0.53%,RSD值為0.53%,與預(yù)測結(jié)果接近,表明該工藝穩(wěn)定可靠,可應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

2.2 產(chǎn)品最佳配方確定

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,具體試驗設(shè)計見表6,各因素擬合得到回歸方程為:Y=93.60000+2.75000A+0.58333B-1.16667C-1.83333D+4.44089E-016AB+0.75000AC+2.50000AD-0.50000BC+0.25000BD+0.75000CD-5.21667A2-5.96667B2-2.34167C2-2.59167D2?；貧w方程方差分析見表7。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface test

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

表8 產(chǎn)品對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 8 Effect of product on organ index in mice

注:與空白組相比較,*表示顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01)。表9、表10同。

由表7可以看出,整體模型P<0.01,失擬項為0.2118,R2為0.9847表明該模型與實際情況擬合較好。將上述方程求解得到最佳的理論參數(shù)為紅參提取液1.89%、紅景天提取液1.53%、大棗汁3.11%、白砂糖5.98%,感官評分預(yù)值值結(jié)果為94.29。綜合回歸模型的預(yù)測和實際生產(chǎn)考慮最終確定最佳的配方參數(shù):紅參提取液2%、紅景天提取液1.5%、紅棗汁3%、白砂糖6%,感官評分為94，與預(yù)測值接近，表明該配方可行。

2.3 產(chǎn)品提高免疫力功能評價結(jié)果分析

2.3.1 臟器指數(shù)試驗結(jié)果 由表8可知,產(chǎn)品組及提取液組的胸腺與脾臟指數(shù)均有提高。與空白組相比,中、高劑量組和紅景天提取液組胸腺指數(shù)差異性顯著(P<0.05),中劑量組差異極顯著(P<0.01)，產(chǎn)品的中、高劑量組和紅參提取液組脾臟指數(shù)差異性顯著(P<0.05)。實驗組的小鼠體重均高于空白組,但無統(tǒng)計學意義。此試驗結(jié)果與孫帆[13]的結(jié)果相似,因為胸腺和脾作為免疫器官可直觀地反映健康狀況,所以本產(chǎn)品有提高免疫力的功效。

2.3.2 細胞免疫功能測定試驗結(jié)果 由表9可知,實驗組的耳腫脹程度均高于空白組,其中與空白組相比,產(chǎn)品高劑量組和紅參提取液組差異顯著(P<0.05),中劑量組差異極顯著(P<0.01),由此可以證明本產(chǎn)品對小鼠的細胞免疫功能有顯著性提高。

表9 產(chǎn)品對小鼠細胞免疫功能的影響Table 9 Effect of product on cellular immune function in mice

2.3.3 NK細胞活性測定試驗結(jié)果 由表10可知,實驗組的乳酸脫氫酶活性高于空白組,與空白組相比,產(chǎn)品的中、高劑量組、紅參提取液組和紅景天提取液組差異顯著(P<0.05),由此表明本產(chǎn)品對小鼠的NK細胞活性有明顯的提升,此試驗結(jié)果與謝向良等[14]的結(jié)果相同。

表10 產(chǎn)品對小鼠NK細胞活性的影響Table 10 Effect of product on the activity of mouse NK cells

3 結(jié)論

實驗獲得紅參最佳提取工藝:液料比32∶1 mL/g、超聲功率270 W、超聲時間32 min。紅景天最佳提取工藝為:液料比40∶1 mL/g、超聲功率300 W、超聲時間30 min;產(chǎn)品最優(yōu)配方為:紅參提取液2%,紅景天提取液1.5%,大棗汁3%,白砂糖6%。給樣組小鼠的臟器指數(shù)、細胞免疫功能、NK細胞活性均高于空白對照組,其中綜合試驗結(jié)果,中劑量組的細胞免疫功能-耳腫脹程度(47.30%±3.38%)比空白組(9.90%±3.41%)提高了37.40%左右,NK細胞活性((766.253±94.021) U/L)比空白組((261.690±69.281) U/L)提高192.81%左右,提高效果較為明顯,說明并不是本產(chǎn)品的劑量越大越好。人參皂苷和紅景天苷的濃度過高時反而不會對機體免疫細胞的活性起到促進作用,因此應(yīng)該選擇合適的劑量。本項目開發(fā)的紅參-紅景天功能飲品產(chǎn)品風味獨特,口感醇厚,有提高免疫力的功效,可作為食品或保健食品用于亞健康人群調(diào)節(jié)免疫力,具有廣闊的市場前景。