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(1.淮海工學院海洋學院,江蘇連云港 222005;2.江蘇耕耘化學有限公司,江蘇連云港 222005)

白色念珠菌(Candidaalbicans)又稱白假絲酵母菌,是一種寄生在人體皮膚、消化道、神經系統(tǒng)等的條件致病性真菌[1],是導致真菌感染的重要致病菌之一,也是重要的食源性致病菌[2]。近年來,白色念珠菌感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,臨床上有效的抗白色念珠菌的藥物非常有限。由于白色念珠菌的自身特性,容易在一些生物材料表面形成生物被膜,且生物被膜對大多數現有的抗真菌藥物都表現出高度耐藥性特點,給臨床治療帶來較大困難[3]。因此,尋找新型抗白色念珠菌以及能夠有效抗生物被膜的藥物顯得意義重大。

海洋作為一個復雜、開放、變化的生物有機系統(tǒng),造就了生物類群的多樣性[4]。海洋中的微生物包括細菌、真菌、放線菌及病毒等,提供地球近一半的初級生產力,能夠影響氣候變化[5],參與物質和能量循環(huán)[6]。海洋微生物及其代謝產物種類豐富,結構特異,已成為21世紀新型藥物研究開發(fā)的熱點[7-8]。其中,海洋細菌分布廣、種類多,產生的活性物質多種多樣、分子結構新穎獨特,被廣泛用于新藥物的開發(fā)[9-10]。

芽孢桿菌(Bacillus)是自然界中種類多、分布廣的優(yōu)勢微生物菌群,大多為非致病性、對人畜無害[11],很多種類具有較強的抑菌作用,能產生多種抗菌物質,具有繁殖能力強、耐熱、耐酸堿等優(yōu)點[12],許多學者從不同環(huán)境中分離篩選到多種具有不同抗菌作用的芽孢桿菌,廣泛用于動植物病害的生物防治。不同種類和來源的芽孢桿菌可以產生不同的抗菌物質,具有不同的抗菌作用機理。已有的研究表明,芽孢桿菌可以產生脂肽類、肽類、磷脂類、細菌素等多種抗菌物質,有的還能產生揮發(fā)性的抑菌物質,具有抑制真菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的作用[13]。其中脂肽類物質是多數芽孢桿菌產生的重要的具有抑菌作用的次級代謝產物,是很多芽孢桿菌發(fā)揮抑菌作用的主要機制。脂肽類物質由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成[14-15],通過疏水脂肪烴鏈和氨基酸作用于靶細胞的細胞膜,擾亂膜結構,使細胞膜受到損傷,最終抑制細胞生長或死亡[16]。也有學者認為,脂肽類抗菌物質吸附于細胞膜上,但不直接作用于細胞膜本身,而是穿過細胞膜,作用于細胞內的生物大分子,例如蛋白質和DNA分子等,最終導致敏感菌株死亡[17]。由于脂肽類物質的抑菌功能,還可以適量添加到食品中提高食品的新鮮程度,延長食品保質期,節(jié)約能源和糧食。

近年來,本課題組在對黃海海域的抗菌海洋微生物資源篩選研究中,分離得到了多個具有抗菌活性的海洋微生物優(yōu)良菌株。發(fā)現一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1菌株及其無菌發(fā)酵液對白色念珠菌(Canidiaalbicans)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、番茄早疫病菌(Alternariasolania)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、蘋果腐爛病菌(Valsamal)、斑點落葉病菌(Alternariaalternate)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cucumarimum)等多種病原菌具有強烈的抑制作用[18-19],且抗菌作用對紫外線、溫度、光照、酸堿度和蛋白酶具有較強的穩(wěn)定性[20],但有關該菌株對白色念珠菌的抑菌作用機理尚未見報道,本文采用掃描電鏡法、MTT法、分光光度法初步探究海洋細菌GM-1-1菌株對白色念珠菌的抗菌作用機理,為該菌株的進一步研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1 本實驗室從連云港海域中分離獲得并保藏;白色念珠菌(Candidaalbicans) 南京便診生物科技有限公司;RPMI1640液體培養(yǎng)基 AR,HyClone公司;四甲基偶氮唑藍(MTT) AR,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、吐溫80、二甲基亞砜、十二水合磷酸氫二鈉 AR,南京化學試劑股份有限公司;鹽酸、玉米糊精、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀 AR,國藥集團化學試劑有限公司;牛肉膏 BR,北京奧博星生物技術有限責任公司。

JSM-6390LA掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社;Ultrospec 3300 Pro核酸蛋白定量儀 通用電氣醫(yī)療集團生命科學部;Tecan Infinite F50酶標儀 帝肯(上海)貿易有限公司;XS-212江南生物顯微鏡 南京向日葵光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 GM-1-1菌株和白色念珠菌活化培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;GM-1-1菌株種子培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、葡萄糖5 g/L,蒸餾水1000 mL;GM-1-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米糊精20 g/L,牛肉膏15 g/L,硫酸鎂1.4 g/L;白色念珠菌種子培養(yǎng)基:PD培養(yǎng)基;白色念珠菌發(fā)酵培養(yǎng)基:沙氏液體培養(yǎng)基,葡萄糖40 g,蛋白胨10 g,蒸餾水1000 mL;YPD液體培養(yǎng)基(用于白色念珠菌生物被膜形成試驗):葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,蒸餾水1000 mL。

1.2.2 GM-1-1無菌發(fā)酵液的制備 將斜面上培養(yǎng)24 h的GM-1-1菌株接種至裝有60 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃,180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h,調整細胞濃度為108個/mL,作為種子液,按10%的接種量接入裝有50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,28 ℃,220 r/min搖床培養(yǎng)28 h。發(fā)酵液在4 ℃、9000 r/min的條件下離心20 min,棄菌體,得無菌體的發(fā)酵液,備用。

1.2.3 GM-1-1無菌發(fā)酵液抗菌性質的初步探究 采用牛津杯法。取培養(yǎng)24 h細胞濃度為106個/mL白色念珠菌菌懸液200 μL,均勻涂布在直徑9 cm的PDA平板上,在平板中央放置1個牛津杯,加入200 μL GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液,28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h,十字交叉法測定抑菌圈的直徑。在無菌操作條件下,用打孔器取抑菌圈內的培養(yǎng)基,表面朝下接種于新鮮PDA平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h,觀察平板上是否有菌落長出。

1.2.4 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌孢子萌發(fā)的影響 1.5 mL EP管中加入培養(yǎng)24 h細胞濃度為105個/mL白色念珠菌菌懸液100 μL和等量的無菌發(fā)酵液充分混勻,再加入100 μL沙氏液體培養(yǎng)基,30 ℃下恒溫培養(yǎng),分別于1、2、3、4、5 h時取培養(yǎng)液于無菌載玻片上,觀察孢子萌發(fā)的情況,計算孢子萌發(fā)率。

1.2.5 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響 采用掃描電鏡法。取抑菌圈邊緣內側的白色念珠菌于掃描電鏡下觀察細胞形態(tài),以正常狀態(tài)培養(yǎng)下的白色念珠菌作為對照,比較處理組與對照組白色念珠菌菌體的細胞形態(tài)變化。

1.2.6 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響

1.2.6.1 白色念珠菌生物被膜的培養(yǎng) 將白色念珠菌接種于YPD培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h,離心收集菌體,用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,調整菌液細胞濃度為1×106個/mL。取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加入100 μL菌液,37 ℃培養(yǎng)2 h,棄去培養(yǎng)基,用pH7.4、0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次,多孔板底部形成白色生物被膜。加入100 μL RPMI1640培養(yǎng)基,作為培養(yǎng)的0點。

1.2.6.2 白色念珠菌生物被膜的測定 采用MTT法。棄去多孔板中最后培養(yǎng)液,用PBS緩沖液輕輕洗去懸浮細胞,每孔加入100 μL PBS緩沖液及20 μL MTT,37 ℃孵育4 h后棄上清,每孔加入100 μL二甲基亞砜,振蕩5 min,室溫靜置30 min后,用酶標儀測定OD492值[21]。每個處理4個孔,為4次重復。

1.2.6.3 不同濃度無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響 在白色念珠菌生物被膜培養(yǎng)的0點,分別加入0%、5%、10%、20%、40%、60%、100%不同稀釋度的GM-1-1發(fā)酵液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,測定不同濃度GM-1-1發(fā)酵液處理的OD492值[22]。比較不同處理的OD值的大小,分析不同濃度無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響。

1.2.6.4 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成不同階段的影響 分別在白色念珠菌生物被膜形成后的0、2、12、24、48、72 h時加入100 μL菌株GM-1-1發(fā)酵液,以等量的RPMI1640培養(yǎng)基為空白對照,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。測定不同處理的OD492值。每個時間為一個處理,每個處理設4個重復。

1.2.7 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌細胞通透性的影響 將培養(yǎng)18 h的白色念珠菌菌懸液10000 r/min離心20 min收集菌體,PBS洗滌三次。用含0.001% Tween80的PBS懸浮細胞,菌體細胞濃度調至109個/mL。向懸浮細胞中加入1.5 mL GM-1-1無菌發(fā)酵液,以等量的無菌水為對照,37 ℃、180 r/min培養(yǎng),分別于0、1、2、4、6 h取樣,4 ℃、10000 r/min離心,測定上清液OD260值。

1.3 數據處理

Excel和Origin 7.0進行數據的處理與分析。

2 結果與分析

2.1 GM-1-1無菌發(fā)酵液抗菌性質初步探究

從圖1可以看到,牛津杯周圍出現了清晰的抑菌圈,抑菌圈直徑達39.5 mm,表明GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液對白色念珠菌具有強烈的抑制作用。

圖1 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of sterile fermentation broth on Candida albicans

取透明圈中央的瓊脂塊接種到新的PDA平板上,培養(yǎng)36 h后平板上長出了白色念珠菌菌落,說明GM-1-1無菌發(fā)酵液處理后的白色念珠菌并未死亡,在轉移至不含無菌發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基上后可繼續(xù)繁殖形成菌落,初步認為GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌的繁殖具有抑制作用,處理后的白色念珠菌不能形成新的細胞,但不能殺死已經形成的細胞。

2.2 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌孢子萌發(fā)的影響

如圖2,用無菌發(fā)酵液處理白色念珠菌的孢子后,活的孢子能夠發(fā)育形成菌落,而死孢子仍為單個細胞。由圖3可知,對照組白色念珠菌的孢子萌發(fā)率隨時間增加迅速提高,5 h時白色念珠菌孢子的萌發(fā)率達到92.44%;而GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液處理的白色念珠菌孢子萌發(fā)率低,5 h時孢子的萌發(fā)率僅為34.22%,明顯低于對照組,說明GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌孢子的萌發(fā)具有較強的抑制作用。

圖2 5 h時白色念珠菌孢子萌發(fā)情況(400×)Fig.2 Spore germination of Candida albicans at 5 h(400×)

圖3 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effect of sterile fermentation broth on spore germination of Candida albicans

2.3 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響

在掃描電子顯微鏡下觀察無菌發(fā)酵液處理的白色念珠菌以及正常生長的細胞形態(tài)發(fā)現,無菌發(fā)酵液處理后的白色念珠菌細胞表面出現明顯凹陷,凹陷大小不一,細胞壁殘缺,細胞上出現破洞,菌體出現不規(guī)則形態(tài)(圖4B);未處理的白色念珠菌菌體細胞完整光滑,形態(tài)規(guī)則、飽滿(圖4A)。說明無菌發(fā)酵液對白色念珠菌的細胞形態(tài)具有較強的破壞作用。該結果與劉全永等[23]通過掃描電鏡觀察分離自海水的凝結芽孢桿菌黑石礁亞種LU-B02菌株發(fā)酵液對白色念珠菌細胞形態(tài)影響的結果一致。

圖4 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響Fig.4 Effect of sterile fermentation broth on cell morphology of Candida albicans

2.4 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響

2.4.1 不同濃度無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響 由圖5可知,GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜的形成影響較為明顯,在供試發(fā)酵液的濃度范圍內,OD492值均顯著低于對照(P<0.05);且隨著發(fā)酵液濃度的增加,OD492值越低,但不同濃度處理的OD492值差異不顯著(P>0.05)。對比談潘莉等[22]采用XTT法評價黃根醇提取物對白色念珠菌生物被膜形成實驗結果,隨著濃度的增加,黃根醇提取物對白色念珠菌生物被膜的抑制作用增強,呈正相關關系,與本實驗結果具有相同的變化趨勢。

圖5 不同濃度的無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effect of different concentrations of sterile fermentation broth on the biofilm formation of Candida albicans注:不同小寫字母代表差異性顯著(P<0.05),圖6、圖7同。

2.4.2 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成不同階段的影響 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜的形成具有明顯的抑制作用,不同時間點的抑制率不同，結果如圖6。0和2 h無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜的抑制作用較強,抑制率分別為89.01%和86.06%,二者差異不顯著(P>0.05);2 h后抑制率明顯下降,不同時間的抑制率均顯著低于0和2 h(P<0.05)。Chandra等[24]將白色念珠菌生物被膜的形成分為3個階段:早期(0～11 h),中期(12～30 h)和成熟期(38～72 h)。早期的黏附尤為重要,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物被膜逐漸發(fā)育成熟,抑制黏附是抗白色念珠菌生物被膜感染的關鍵措施[22]。

圖6 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成不同階段的影響Fig.6 Effect of sterile fermentation broth on different stages of Candida albicans biofilm formation

2.5 GM-1-1無菌發(fā)酵液對白色念珠菌細胞通透性的影響

如圖7所示,在1～6 h范圍內,處理組的OD260值均高于對照組,隨著培養(yǎng)時間的增長,對照組與處理組OD值的差異越來越大,達到顯著水平(P<0.05)。培養(yǎng)時間為6 h時,對照組的OD260值為0.506,而處理組的OD260值為0.697,明顯高于對照組,表明無菌發(fā)酵液對白色念珠菌的細胞通透具有一定的影響。孟松[25]將從藠頭中分離出的活性物質作用于白色念珠菌,細胞通透性試驗結果表明，藠頭活性物質導致白色念珠菌OD260特征吸收值物質的泄露,破壞了細胞的通透性,導致細胞活力下降甚至死亡。

圖7 無菌發(fā)酵液對白色念珠菌細胞通透性的影響Fig.7 Effect of sterile fermentation broth on the permeability of Candida albicans cells

3 結論

本文以白色念珠菌為指示菌,初步探討了GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液對白色念珠菌的抗菌性質及其抗菌作用機理。實驗結果表明，GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液能明顯抑制白色念珠菌的生長和繁殖，抑菌圈直徑達39.5 mm,對孢子萌發(fā)具有強烈的抑制作用，GM-1-1菌株無菌發(fā)酵液處理5 h時孢子萌發(fā)率僅為34.22%;能夠破壞白色念珠菌的細胞形態(tài);抑制白色念珠菌生物被膜的形成；破壞了細胞的通透性。本試驗結果為該菌株的進一步開發(fā)和研究奠定了一定的理論基礎。