胡 濤,丁 波,顧 利,陳大玲,劉紅娜

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730024)

酪蛋白酸鈉是通過堿(NaOH、NaHCO3、NaCO3)中和酸性酪蛋白產生的,其干粉完全溶解在水中,產生一種粘稠的淡黃色的溶液[1]。酪蛋白酸鈉是集乳化性、起泡性、保水性等功能特性和高營養(yǎng)價值于一體的優(yōu)良天然食品配料[2-3]。制取酪蛋白酸鈉的方法比較多,就原料而言既可以從脫脂乳開始也可以從脫脂奶粉為原料進行[4]。以脫脂乳為原料加HCl凝乳、NaOH中和并最后噴霧干燥成粉。但我國鮮奶資源不足,針對原奶產量低,成本高的現(xiàn)狀[5],曲拉是我國生產酪蛋白酸鈉的主要原料。曲拉溶解后利用等電點將酪蛋白凝結,再添加NaOH堿液,調節(jié)pH最后經噴霧或冷凍干燥后得酪蛋白酸鈉。但曲拉原料采用此法生產的產品與鮮奶原料的產品相比,工藝流程長。以曲拉為原料生產酪朊酸鈉,其原料來源豐富、成本低,較鮮奶容易保存,對調整企業(yè)產品結構,促進少數(shù)民族地區(qū)經濟發(fā)展具有積極意義。

“曲拉”(藏語,指奶干渣)是藏區(qū)牧民利用牦牛乳預煮加熱、殺菌、發(fā)酵、加熱凝塊、脫水所制得的粗酪蛋白,青藏高原牧民將牦牛乳的80%制成“曲拉”,以方便貯存。且曲拉是中國獨有的資源[3],因而備受研究者的廣泛關注。目前,關于曲拉制酪蛋白酸鈉的方法主要是通過浸泡溫度、浸泡時間、水洗次數(shù)的方法直接浸泡法制取酪蛋白酸鈉[5]。傳統(tǒng)工藝是再提純法,是經點酸凝聚出酪蛋白后又經膠磨、轉化中和后干燥后制取酪蛋白酸鈉產品,通過酸凝沉淀后再提純酪蛋白的同時,排出乳清。直接浸泡法比傳統(tǒng)再提純法減少了提取工藝,獲得較好的乳糖分離效果[6]。但以曲拉為原料制取酪蛋白酸鈉的報道比較少,且工序復雜,目前對于加水量、加熱時間以及溫度的研究沒有報道。

本實驗以酪蛋白酸鈉產率為指標,以牦牛乳曲拉為原料制取酪蛋白酸鈉的凝乳加水量、堿溶pH、加熱時間3個因素對產率的影響,以單因素實驗結果為基礎,采用Box-Behnken試驗設計對曲拉制酪蛋白酸鈉工藝參數(shù)進行優(yōu)化,并對產品進行理化、功能性評價。本文優(yōu)化了原有曲拉制酪蛋白酸鈉的方法及條件,得到優(yōu)質的酪蛋白酸鈉產品,且充分利用牦牛乳曲拉資源,發(fā)展牧區(qū)經濟,增加牧民收入,最終達到促進民族經濟全面增長。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曲拉 產地西藏;植物油 金龍魚精煉一級大豆油,陜西省咸陽市興平食品工業(yè)園;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、硫酸銅、氨水、乙醚、石油醚、乙醇、冰乙酸、乙酸鈉、苯酚、硫酸、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉(SDS) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

PHBJ-260型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;LGJ-10型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;KND-04型自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器公司;NDJ-1型旋轉黏度計 上海精密科學儀器有限公司;M-371450型漩渦震蕩儀 北京中西遠大科技有限公司;XZ-16T 型高速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;APV-60 型高壓均質機 上海順儀實驗設備有限公司;V-5000型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 曲拉溶液的制備→加酸沉淀→離心脫水→酪蛋白凝塊→加水→研磨→堿溶→加熱→滅菌→冷凍干燥→酪蛋白酸鈉[7]

1.2.2 操作要點 曲拉溶液的制備:曲拉粉碎過100目篩,按質量比1∶20與蒸餾水配置成懸濁液,室溫下浸泡2 h。用5 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)體系的pH為9.0。將曲拉溶液置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中以300 r/min,55 ℃下加熱30 min,然后用100目紗布過濾,濾液待用[8]。

加酸沉淀:向離心脫脂后的濾液中加入1 mol/L鹽酸,調節(jié)體系的pH為4.6,使酪蛋白凝塊析出;加水:參照Mulvihill的方法,向酪蛋白凝塊中加水[7];研磨:將加水后的酪蛋白凝塊移至研缽中研磨。

堿溶:向漿液中加入5 mol/L氫氧化鈉,調節(jié)體系pH為7.0,進行溶解,時間為10 min;加熱:參照Mulvihill的方法確定加熱體系的溫度為75 ℃[7]。冷凍干燥:預先將料液放入-80 ℃中冷凍,待完全凍結,移至冷凍干燥機中干燥處理24 h。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 凝乳加水量的選擇 參照Mulvihill的方法并作適當修改,將得到的酪蛋白凝塊分別加水15%、25%、35%、45%、55%[7],將漿液體系配制成pH7.0,加熱時間20 min,制備酪蛋白酸鈉,測定產率。

1.2.3.2 堿溶解的pH的選擇 將酪蛋白凝塊加水35%,參照Mulvihill的方法并作適當修改,研磨后分別將漿體系配制成pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0[7],加熱時間20 min,最后測定酪蛋白酸鈉的產率。

1.2.3.3 加熱時間的選擇 酪蛋白凝塊加水35%,將漿液體系配制成pH7.0,分別將加熱時間設制成10、15、20、25、30 min,最后測定酪蛋白酸鈉的產率。

1.2.4 響應面優(yōu)化實驗設計 選取酪蛋白凝塊的加水量(A)、堿溶解的pH(B)、加熱時間(C)為自變量,以酪蛋白酸鈉的產率(Y)為響應值,根據Box-Behnken的中心組合實驗設計對曲拉制酪蛋白酸鈉的工藝進行優(yōu)化,各因素水平見表1。建立回歸模擬方程,確定酪蛋白酸鈉的最佳條件,并加以驗證。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 曲拉酪蛋白酸鈉產率的計算 準確稱取所制備的曲拉酪蛋白酸鈉,測定其總的含酪蛋白量與曲拉原料中的酪蛋白總質量相比,即為曲拉酪蛋白酸鈉的產率[7-8]。蛋白含量采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)測定。按下式計算曲拉酪蛋白酸鈉的產率:

曲拉酪蛋白酸鈉產率(%)=曲拉酪蛋白酸鈉酪蛋白的質量/曲拉中酪蛋白總質量×100

1.2.6 理化性質的測定 粗蛋白含量采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)測定[9];乳糖含量測定采用劉紅娜的方法[3];粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB 5009.6-2010)測定[10];酪蛋白酸鈉的含水率的測定采用直接干燥法(GB 5009.3-2010)測定[11];灰分含量的測定,按照GB 5009.4-2010方法[12];pH的測定:將酪蛋白酸鈉配成2%水溶液,在溫度約20 ℃下,用酸度計測定[1]。

1.2.7 功能性質的測定

1.2.7.1 酪蛋白酸鈉溶液的配制 將粉碎后的酪蛋白酸鈉,用pH7.0的1.0 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀)配制成2.0 mg/mL的酪蛋白酸鈉溶液。室溫磁力攪拌3 h,進行溶解,備用[13-14]。

1.2.7.2 酪蛋白酸鈉乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 取配制好的2.0 mg/mL的酪蛋白酸鈉溶液6 mL于離心管中,2 mL植物油,采用均質機對混合液進行分散16000 r/min,1 min,立即取50 μL的乳狀液與5 mL 0.1%的SDS溶液混合,采用漩渦震蕩儀振蕩5 s后,在500 nm下測定其吸光值A0,乳狀液靜置10 min后采用上述相同的方法對乳狀液吸光值進行測定,記為A10,用0.1%的SDS溶液做空白對照[3]。按下式計算酪蛋白酸鈉的乳化性(EA)及其乳化穩(wěn)定性(ESI):

表2 感官評分標準表Table 2 Sensory evaluation scale

1.2.7.3 酪蛋白酸鈉起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定 取配制好的2.0 mg/mL的酪蛋白酸鈉溶液50 mL于離心管中,采用均質機對其進行分散16000 r/min,2 min,迅速轉入100 mL量筒中。記錄體積V0,30 min后記錄體積V30[3]。按下式計算酪蛋白酸鈉的起泡性及其氣泡穩(wěn)定性:

1.2.7.4 酪蛋白酸鈉黏度的測定 采用NDJ-1型旋轉式黏度計,1號轉子,轉速30 r/min[15]。取配制好的2 mg/mL 的酪蛋白酸鈉溶液30 mL注入黏度計的測量杯中,當指針穩(wěn)定后讀數(shù)。按下式計算酪蛋白酸鈉的黏度。重復3次,取平均值。

η=k·α

式中:η:粘度;k:系數(shù);α:指針所指讀數(shù)。

1.2.7.5 持水性的測定 準確稱取酪蛋白酸鈉0.5 g,加入5 mL蒸餾水于已知質量的離心管中,渦旋混合5 min,室溫下靜置2 h后,在3000 r/min下離心20 min,將上清液輕輕倒出,稱離心管和沉淀的質量[8]。按下式計算:

式中:WHC:持水率,g/g;W0:干樣品的質量,g;W1:離心管和干樣品的質量,g;W2:離心管和沉淀的質量,g。

1.2.7.6 感官評定 酪蛋白酸鈉的感官評定,方法參考文獻[1]。選擇大學本科以上的有經驗型、無經驗型、訓練型的人員進行評定,評定項目參照GB 1886.212-2016中感官要求,主要是色澤、顆粒狀態(tài)、滋氣味、雜質四項。

1.3 數(shù)據處理

采用Box-Behnken Design試驗設計響應曲面,統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 22數(shù)據系統(tǒng)中的Duncan’s法對數(shù)據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酪蛋白凝乳加水量的確定 從圖1可知,當加水量為15%～35%時,酪蛋白酸鈉產率隨加水量的增加而提高。這可能是由于酪蛋白凝乳的結構具有相對不可滲透性,附著在酪蛋白微粒表面的粘性涂層阻礙酪蛋白在堿液中的溶解,在酪蛋白凝乳中加入水,可與其形成的混合液能夠減小其微粒從而增加了酪蛋白酸鈉的產率[7]。當凝乳加水量為35%時,酪蛋白酸鈉產率最大;當加水量為35%～55% 時,酪蛋白酸鈉的得率隨加水量的增大而呈下降的趨勢。綜上所述,酪蛋白凝乳的最佳加水量為35%。

圖1 加水量對酪蛋白酸鈉得率的影響Fig.1 Effect of water addition on yield of sodium caseinate

2.1.2 堿溶pH的確定 從圖2可知,酪蛋白酸鈉的產率隨著pH的增大而降低,在pH為6.0時,酪蛋白酸鈉產率最高;pH過低,凝乳溶解不徹底,影響酪蛋白酸鈉的溶解度[16]。當pH大于7時,凝漿中的蛋白質會以脫酰胺基和脫磷酸作用形式發(fā)生堿性降解,使體系中能夠與堿反應的蛋白質減少[7],從而影響酪蛋白酸鈉的產率。綜上所述,堿溶最佳pH為7.0。

圖2 堿溶pH對酪蛋白酸鈉得率的影響Fig.2 Effect of pH on yield of sodium caseinate

2.1.3 加熱時間的確定 從圖3可知,當加熱時間為10～20 min時,酪蛋白酸鈉的產率隨著加熱時間延長而提高,這可能是因為熱處理導致了蛋白質分子的極化,維持空間結構的非共價鍵作用力被打破,酪蛋白分子部分展開,蛋白質分子和溶劑相互作用加強,從而提高酪蛋白與氫氧化鈉的接觸面積[17-19],使酪蛋白酸鈉的產率增加。當加熱時間為20 min時,酪蛋白酸鈉產率達到最大,此時酪蛋白疏水性最大。當加熱時間為20～30 min時,酪蛋白酸鈉的產率隨著加熱時間的延長而逐漸降低?？赡苁请S著加熱時間的延長,酪蛋白酸鈉吸收熱量由原來的有序狀態(tài)變?yōu)闊o序狀態(tài),分子的相互作用被破壞,多肽鏈展開[3]。綜上所述,最佳加熱時間為20 min。

圖3 加熱時間對酪蛋白酸鈉得率的影響Fig.3 Effect of heat-up time on yield of sodium caseinate

2.2 響應面優(yōu)化實驗試驗與分析

2.2.1 模型建立與方差分析 在單因素試驗的基礎上以凝乳的加水量(A)、堿溶pH(B)和加熱時間(C)3個因素為自變量,以酪蛋白酸鈉產率(Y)為響應值利用Box-Behnken設計17個試驗點的響應面分析試驗,分為12個析因點和5個零點,中心試驗重復5次,用以估計試驗誤差,如表3所示。

表3 響應面試驗設計方案與結果Table 3 Design and results of response surface experiment

表4 響應面方差分析Table 4 Anova analysis of response surface model

從表3可知,利用Design Expert 8. 0. 6軟件對數(shù)據進行二次多元回歸擬合,得到酪蛋白酸鈉的產率(Y)對自變量加水量(A)、堿溶pH(B)和加熱時間(C)之間的二次多項回歸方程為:Y(%)=47.25+0.27A+0.28B+2.27C-0.48AB+0.50AC-2.59 BC-4.57A2-6.68B2-3.91C2。

2.2.2 多元回歸模型分析 為了說明回歸方程的有效性及各因素對酪蛋白酸鈉產率的影響程度,對回歸方程進行了方差分析。由表4可以看出回歸模型的F=113.64,P<0.0001,說明響應面回歸模型極顯著,失擬項F=6.58,P>0.05,說明該模型失擬不顯著,與實際擬合良好。模型中一次項C、交互項BC、二次項(A2、B2、C2)的P≤0.0001,表明對實驗結果影響極顯著。多元相關系數(shù)R2=0.9864,說明相關性較好;證明該回歸模型能充分說明酪蛋白酸鈉的工藝優(yōu)化過程。各因素對酪蛋白酸鈉產率影響的主次順序為:C>B>A,即加熱時間>堿溶pH>凝乳加水量。

2.2.3 響應面優(yōu)化實驗結果分析 由圖4可知,隨著加水量和堿溶pH的增加,酪蛋白酸鈉的產率均呈先上升后下降的趨勢。由表4可知,加水量和堿溶pH的交互作用不顯著。在加水量為35%,堿溶pH=7.0時,酪蛋白酸鈉的產率達到最大值。由曲面坡度的陡峭情況得知,堿溶pH的曲面比加水量的曲面更陡,說明堿溶pH對酪蛋白酸鈉產率影響更加顯著,響應面圖形呈鐘形。

圖4 加水量和堿溶pH對產率的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour of water addition and pH on yield

由圖5可知,隨著凝乳加水量的增加,酪蛋白酸鈉產率呈先上升后下降的趨勢,而隨著加熱時間的延長,酪蛋白酸鈉產率呈先上升后緩慢下降的趨勢。由表4可知,凝乳加水量和加熱時間的交互作用不顯著。由曲面坡度的陡峭情況得知,加熱時間的曲面比凝乳加水量的曲面更陡,說明加熱時間對酪蛋白酸鈉產率影響更加顯著,響應面圖形呈鐘形。

圖5 加水量和加熱時間對產率的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour of water addition and heat-up time on yield

由圖6可知,隨著堿溶pH的增加,酪蛋白酸鈉產率呈先增加后下降的趨勢,而隨著加熱時間的延長,酪蛋白酸鈉產率呈先增加后下降的趨勢。由表4可知,凝乳加水量和加熱時間的交互作用顯著。由曲面坡度的陡峭情況得知,加熱時間的曲面比堿溶pH的曲面更陡,說明加熱時間對酪蛋白酸鈉產率影響更加顯著。

圖6 加熱時間和pH對產率的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour of heat-up time and pH on yield

2.2.4 驗證實驗 通過Design Expert軟件分析結果可知,酪蛋白酸鈉的優(yōu)化工藝條件為:凝乳加水量35%,堿溶pH為7.0,加熱時間20 min。在最佳工藝條件下進行三組驗證性試驗,平均值為45.85%,與對應條件下的酪蛋白酸鈉的理論產率47.68%相差1.83個百分點,表明實際值與模型預測的最佳值基本接近,說明采用響應面優(yōu)化的生產工藝參數(shù)準確可靠,按照建立的模型進行試驗在實踐中是可行的。

2.3 酪蛋白酸鈉理化指標

為了考察優(yōu)化后的酪蛋白酸鈉的相關理化指標及感官指標是否合格,測定了成品的粗蛋白、乳糖、粗脂肪、含水率、灰分、pH與GB 1886.212-2016相比較,結果列于表5。

由表5可以看出,酪蛋白酸鈉經優(yōu)化加工處理后粗蛋白含量高;其灰分含量與朱雄英等[6]通過浸洗法所制得的酪蛋白酸鈉的灰分含量相近,證明經過優(yōu)化后的加工工藝可以直接代替原料的多次浸洗法,并且其乳糖含量低,便于后期長期貯藏。

2.4 酪蛋白酸鈉功能性質

酪蛋白酸鈉制品在食品工業(yè)的應用性能取決于其功能特性[20-22],本試驗利用濃度為2%的酪蛋白酸鈉進行其乳化性、起泡性、黏度、持水性研究,利用最優(yōu)工藝的條件下所生產的酪蛋白酸鈉的功能性質測定結果見表6。已有學者報道,pH7時曲拉酪蛋白黏度2 mPa·s以下,乳化力不同溫度下為15%～30%,起泡性為7%～18%[15]。酪蛋白酸鈉與曲拉酪蛋白相比,功能性良好。

表5 酪蛋白酸鈉的成分Table 5 The composition of the sodium caseinate

表6 酪蛋白酸鈉功能性結果Table 6 Results of functional properties of sodium caseinate

2.5 酪蛋白酸鈉感官評定

由表7可知,在最優(yōu)工藝下制備出來的酪蛋白酸鈉產品顏色呈乳白色,有微量的黃色顆粒,無雜質;顆粒大小均勻,粉末狀;氣味溫和,有特別的奶香味,符合GB 1886.212-2016要求。

表7 酪蛋白酸鈉感官評定結果Table 7 Results of sensory evaluation of sodium caseinate

3 結論

通過單因素和Box-Behnken Design試驗設計響應曲面法優(yōu)化,確定了曲拉制酪蛋白酸鈉的生產工藝的最佳條件為:加水量35%,堿溶pH7.0,加熱時間為20 min。該條件下酪蛋白酸鈉的產率較高為45.85%,粗蛋白91.13%、乳糖0.36%、脂肪1.33%、水分4.41%、灰分4.83%;乳化性為13.39%、起泡性為17.65%、粘度為5.59 mPa·s、持水性為0.75 g/g。且產品具有酪蛋白酸鈉特有的滋味和氣味,呈乳白色粉末;無雜質;顆粒大小均勻。本試驗實現(xiàn)了以曲拉為原料,用最簡步驟得到酪蛋白酸鈉產品。通過對最優(yōu)工藝條件的探索,使酪蛋白酸鈉產率提高,且功能性良好。