李亞榮， 張 帥， 雒珺瑜， 朱香鎮(zhèn)， 王 麗， 崔金杰

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽455000

據(jù)報道，截至2017 年，24 個國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達到1.898 億hm2(國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織，2018)。 我國轉(zhuǎn)基因棉花的成功培育和商業(yè)化種植促進了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻、玉米等作物的發(fā)展。 轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展，在節(jié)約土地面積、解決我國部分地區(qū)的糧食短缺問題、減少農(nóng)藥污染方面創(chuàng)造了巨大的社會以及經(jīng)濟效益(高欣欣等，2018； 郭三堆等，2015)。 然而，與其他技術(shù)一樣，轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境的安全性也引起了人們的關(guān)注(范俊韜和李俊生，2007； 郭建英等，2008； 馬祥建和郝德榮，2011； 吳啟佳等，2016)。 轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模種植可能會對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成影響。 因此，任何轉(zhuǎn)基因作物進行商業(yè)化種植之前都必須經(jīng)過嚴(yán)格的環(huán)境風(fēng)險評價(路獻勇等，2017)。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對農(nóng)田重要非靶標(biāo)生物的影響是生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評價的重要內(nèi)容(楊艷等，2014)，其中，對非靶標(biāo)生物尤其是在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色的天敵昆蟲的影響更應(yīng)該倍加重視(高欣欣等，2018)。

龜紋瓢蟲Propylea japonica(Thunberg)屬鞘翅目瓢蟲科龜紋瓢蟲屬，具有耐高溫和捕食能力強等特點，是農(nóng)田捕食性天敵的優(yōu)勢類群，可捕食棉蚜、飛虱、棉鈴蟲等多種害蟲，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因棉田的重要非靶標(biāo)指示性天敵昆蟲(郭傳斌，2017； 劉艷敏，2016； 楊燕芳，2013)。

已有研究表明，Bt 蛋白對龜紋瓢蟲解毒相關(guān)基因表達量、解毒酶活性、消化酶活性和腸道微生物沒有不利影響(雒珺瑜等，2015； 王英麗，2014； 趙耀，2016)，而關(guān)于Bt 蛋白對非靶標(biāo)生物體內(nèi)游離氨基酸的影響目前還未見報道。 鑒于此，本研究以龜紋瓢蟲為實驗材料，研究Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲不同齡期的發(fā)育歷期、新羽化成蟲的體重、雌雄比例及體內(nèi)氨基酸種類和數(shù)量的影響，重點研究龜紋瓢蟲取食不同濃度的Bt 蛋白后體內(nèi)游離氨基酸的種類和含量的變化，以期為轉(zhuǎn)基因棉花的環(huán)境安全評價積累科學(xué)數(shù)據(jù)，為轉(zhuǎn)基因生物的安全管理提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及飼養(yǎng)方法

龜紋瓢蟲采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場實驗基地，飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲籠(50 cm×50 cm×50 cm)，室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)5 代后備用。 飼養(yǎng)條件：光照L/D=14 h/10 h，溫度(25±1)℃，濕度70%±10%；豌豆蚜為實驗室擴繁多年的種群，以蠶豆為寄主，在培養(yǎng)箱內(nèi)擴繁，擴繁條件：光照L/D=14 h/10 h，溫度(20±1)℃，濕度70%±10%。

1.2 供試化合物

0.005 、0.05、0.5 mg·mL-1Cry2Ab 蛋白(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所植保生物技術(shù)研究室)；0.5 mg·mL-1E-64 蛋白酶抑制劑(美國Sigma 公司)；2 mol·L-1蔗糖(索萊寶科技有限公司)。 E-64蛋白酶抑制劑和Cry2Ab 蛋白均以2 mol·L-1蔗糖溶液為溶質(zhì)進行配制。

1.3 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲生物學(xué)的影響

收集龜紋瓢蟲卵塊置于培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱光照L/D=14 h/10 h、溫度(25±1)℃、濕度70%±10%條件下孵化，然后將幼蟲挑至1.5 mL 離心管單管飼養(yǎng)。 用足量豌豆蚜飼喂龜紋瓢蟲，龜紋瓢蟲幼蟲共有4 個齡期，在每個齡期蛻皮后，用2.5 μL 移液槍吸取0.5 mg·mL-1的Cry2Ab 蛋白1.0 μL 至1.5 mL 離心管壁上，飼喂處理24 h，以2 mol·L-1蔗糖溶液作為陰性對照；以0.5 mg·mL-1E-64 溶液作為陽性對照。 分別記錄不同處理條件下龜紋瓢蟲不同齡期的發(fā)育歷期、羽化后12 h 內(nèi)成蟲的體重及性別比例。 每個處理設(shè)置30 頭幼蟲，3 個平行重復(fù)。

1.4 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲體內(nèi)氨基酸種類和含量的影響

收集龜紋瓢蟲卵塊置于培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱光照L/D=14 h/10 h、溫度(25±1)℃、濕度70%±10%條件下孵化，然后將幼蟲挑至1.5 mL 離心管單管飼養(yǎng)，用足量豌豆蚜飼喂龜紋瓢蟲初孵幼蟲至3齡。 用2.5 μL 移液槍分別吸取0.005 和0.05 mg·mL-1的Cry2Ab 蛋白1.5 μL 至1.5 mL 離心管壁上，飼喂處理72 h(每個處理設(shè)置30 頭幼蟲，5 個重復(fù))，以2 mol·L-1蔗糖溶液作為空白對照。 收取上述樣品，測定龜紋瓢蟲3 齡幼蟲體內(nèi)氨基酸的種類和含量。

游離氨基酸測定： 分別稱取0. 005、 0.05 mg·mL-1Cry2Ab 蛋白處理和2 mol·mL-1蔗糖溶液處理的樣品0.1 g，在液氮低溫環(huán)境中充分研磨；研磨充分后加入2 mL 0.01 mol·L-1的鹽酸，靜置30 min 后搖勻浸提樣品，然后在12000 r·min-1、4℃條件下離心10 min；準(zhǔn)確吸取1.5 mL 上清液于離心管中，加入1.5 mL 8%的磺基水楊酸，充分混勻，靜置15 min；取上清液，通過0.45 μm 的微孔濾膜過濾后上機檢測氨基酸種類和含量。 氨基酸分析采用S-433D 型全自動氨基酸分析儀(德國賽卡姆公司)。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差處理和分析，采用單因素方差分析和Duncan′s 差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲生物學(xué)的影響

2.1.1 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲發(fā)育歷期的影響

由表1 可知，E-64 蛋白酶抑制劑處理后，龜紋瓢蟲2、3、4 齡，預(yù)蛹以及蛹的羽化歷期與Cry2Ab 蛋白處理和蔗糖對照處理相比均明顯延長，說明本實驗處理方法有效。 與蔗糖對照組相比，取食Cry2Ab 蛋白后龜紋瓢蟲幼蟲的2、3、4 齡的發(fā)育歷期及預(yù)蛹和蛹期均沒有顯著性差異。 可見，Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲幼蟲的發(fā)育歷期和化蛹及蛹的歷期均沒有顯著影響。

2.1.2 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲成蟲體重的影響

Cry2Ab 蛋白處理組的雌蟲平均體重為7.37 mg，雄蟲平均體重為5.99 mg，蔗糖組雌蟲平均體重為7.56 mg，雄蟲平均體重為6.19 mg，不同處理對雌雄成蟲體重影響不大，且雄蟲體重均低于雌蟲。 說明Cry2Ab 蛋白處理對龜紋瓢蟲雌雄體重沒有影響。

2.1.3 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲雌雄比例的影響

Cry2Ab 蛋白處理組和蔗糖對照組的雌、雄蟲比例相近。 Cry2Ab 蛋白處理組中龜紋瓢蟲的雌蟲比例為20%，雄蟲比例為80%；蔗糖對照組中雌蟲比例為23%，雄蟲比例為77%，雌、雄蟲比例之間差異未達顯著水平。 說明Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲成蟲的雌雄性比無明顯影響。

表1 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲發(fā)育歷期的影響Table 1 Effect of Cry2Ab protein on the developmental duration of P. japonica

2.2 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲體內(nèi)氨基酸種類和含量的影響

取食不同濃度Cry2Ab 蛋白的龜紋瓢蟲幼蟲體內(nèi)主要氨基酸種類與蔗糖對照組相同，均為纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸；不同處理條件下，龜紋瓢蟲幼蟲體內(nèi)8 種主要游離氨基酸含量最高的是賴氨酸，組氨酸次之，蛋氨酸含量最低，且Cry2Ab 蛋白處理組與蔗糖對照組相比無顯著差異。 可見，Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲幼蟲體內(nèi)主要氨基酸種類及含量無顯著影響，即對幼蟲體內(nèi)代謝沒有顯著影響(表2)。

表2 Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲體內(nèi)氨基酸種類和含量的影響Table 2 Effect of Cry2Ab protein on amino acid composition and content in P. japonica

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因作物的推廣和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟加速了轉(zhuǎn)基因作物在全球的商業(yè)化種植，隨之而來的潛在的環(huán)境安全問題也引起了人們的關(guān)注。 轉(zhuǎn)基因作物對非靶標(biāo)昆蟲的影響是潛在環(huán)境安全問題關(guān)注的焦點之一(周霞等，2018)。 轉(zhuǎn)基因作物表達的目的蛋白可以通過食物鏈從植物傳遞給天敵，從而使天敵暴露于轉(zhuǎn)基因作物所表達的蛋白環(huán)境中(高欣欣等，2018)。 對非靶標(biāo)昆蟲的影響是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評價的重要內(nèi)容(Ramirez-Romero et al.，2008)。

已經(jīng)有研究從不同方面評估了Bt 蛋白對非靶標(biāo)性昆蟲沒有顯著影響。 有研究表明轉(zhuǎn)基因棉田里的節(jié)肢動物群落昆蟲結(jié)構(gòu)和組成，生物多樣性等與非轉(zhuǎn)基因棉田無顯著性差異(雒珺瑜等，2016)；Chen et al.(2015)研究表明，Bt 水稻上褐飛虱卵對綠盲蝽Apolygus lucorμm (Meyer-Dür.)的生存能力(成蟲羽化率和卵孵化率)、發(fā)育期(卵期，若蟲發(fā)育期)、成蟲鮮重、成蟲壽命和繁殖力沒有顯著影響。 Yang et al.(2017)研究顯示Bt 蛋白對非靶標(biāo)昆蟲蜘蛛的種群密度、捕食能力、相對豐度沒有負(fù)面影響。

轉(zhuǎn)基因作物對捕食性天敵影響的研究具有非常重要的經(jīng)濟學(xué)和生物學(xué)意義，在害蟲綜合防治中也具有重要地位(李麗莉，2004)。 大量試驗研究了Bt 蛋白對非靶標(biāo)捕食性天敵的影響。 研究表明，中華通草蛉Chrysoperla sinica (Tjeder)取食含Cry1Ab蛋白的飼料后幼蟲的發(fā)育歷期、結(jié)繭率、繭期、羽化率、成蟲體重等生物學(xué)參數(shù)與取食不含Cry1Ab 蛋白的飼料處理相比均沒有顯著差異(高欣欣，2017)。 Ali et al. (2017a) 通 過 分 析 Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ca、Cry1F 蛋白對異色瓢蟲Harmonia axyridis (Pallas)化蛹率、羽化率、7 d 幼蟲重量、性比和體重的影響來評估轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境的風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，含Cry1Fa 的轉(zhuǎn)基因作物對草蛉沒有不利影響(Ali et al.，2017b)。 以食物鏈為切入點的研究發(fā)現(xiàn)蚜蟲不受Cry 蛋白的影響，從而消除了獵物質(zhì)量對天敵寄生蜂等的影響(Tian et al.，2015)。 有研究發(fā)現(xiàn)帶有Bt 蛋白的煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)被龜紋瓢蟲取食后，其生長發(fā)育和捕食量沒有明顯變化(顧愛祥，2012)。 龜紋瓢蟲取食含Bt 的水稻花粉后，其幼蟲、蛹的生長發(fā)育和成蟲生殖參數(shù)與取食非轉(zhuǎn)基因水稻花粉的相比無顯著差異(白耀宇，2004)。 張小潔(2014)研究表明，轉(zhuǎn)Cry2A 和Cry1C 基因的水稻對龜紋瓢蟲的生長發(fā)育不會產(chǎn)生負(fù)面影響。 目前，大多數(shù)的研究表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對非靶標(biāo)昆蟲，特別是對有益昆蟲如捕食性天敵沒有明顯的不利影響(李麗莉等，2004)。 這些結(jié)論和本研究結(jié)果一致，龜紋瓢蟲取食Cry2Ab 蛋白后其發(fā)育歷期、成蟲體重，雌、雄蟲比例與對照組相比均沒有顯著變化。

蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要組成成分和構(gòu)成機體組織、器官的重要組成部分。 構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸，組織中的游離氨基酸可以直接參與機體蛋白質(zhì)合成和氨基酸代謝。 本研究以體內(nèi)游離氨基酸為切入點，發(fā)現(xiàn)取食不同濃度的Cry2Ab 蛋白后龜紋瓢蟲幼蟲體內(nèi)主要氨基酸種類與蔗糖對照組相同，均為纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸；與對照組相比，龜紋瓢蟲幼蟲體內(nèi)8 種主要游離氨基酸的含量也沒有明顯差異。 可見，Cry2Ab 蛋白對龜紋瓢蟲體內(nèi)主要氨基酸種類及含量無顯著影響。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入和不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)力度和商業(yè)化種植的規(guī)模將逐漸擴大。一種新型轉(zhuǎn)基因作物在商業(yè)化種植之前必須進行安全評價工作，特別是對非靶標(biāo)天敵的影響。 本研究以非靶標(biāo)天敵昆蟲龜紋瓢蟲為研究對象，從發(fā)育歷期、成蟲體重，雌、雄蟲比例、游離氨基酸種類和含量的變化說明了Cry2Ab 蛋白對其生物學(xué)特性和氨基酸代謝沒有顯著影響。 本研究結(jié)果可為轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)種植和推廣提供參考依據(jù)。