雷水娟， 劉二龍， 盧 麗， 呂英姿， 蔣 湘， 李嘉琪， 夏柔菲江西科技師范大學生命科學學院，江西 南昌008； 黃埔海關，廣東 廣州5070；廣州海關， 廣東 廣州506

棉花是一種富含蛋白質、油和料纖維的高附加值經濟作物，其含纖維素87%～90%，常作為紡織和服裝的一種重要原料(畢美超，2016)。 2018 年我國棉花種植面積為335.23 萬hm2，全國棉花總產量609.6萬t (國家統(tǒng)計局，2018)，2017 年我國累計進口棉花115.48 萬t，比2016 年增長29%(搜棉網，2018)。

MON88701 是一種耐受麥草畏和草銨膦2 種除草劑的轉基因棉花品系，由孟山都公司研發(fā)。MON88701 經由農桿菌介導PV-GHHT6997 質粒轉入Coker 130 棉花研發(fā)而成，其T-DNA 含有dmo 基因盒和bar 基因盒，分別編碼麥草畏單加氧酶和膦絲菌素N-乙酰轉移酶，它們在轉基因植株內均為1個拷貝。 MON88701 最早于2013 年在美國上市，目前在巴西、澳大利、新西蘭、加拿大、哥倫比亞等國家已經獲得批準種植或允許用作食品、飼料原料，但在我國尚未獲得農業(yè)部批準。

2016 年歐盟轉基因食物與飼料基準實驗室建立了一種MON88701 品系特異性的實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測方法(European Union， 2016)， 但 目 前 國 內 尚 未 見MON88701 品系特異性檢測方法的報道。 為打破其他國家和地區(qū)設置的轉基因產品貿易技術壁壘，完善我國轉基因產品品系識別及定量檢測技術體系，保護消費者對轉基因產品的知情權，本研究基于MON88701 5′端鄰接區(qū)序列，建立MON88701 品系特異性實時熒光PCR 檢測方法，為相關部門監(jiān)管轉基因棉花MON88701 品系提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 供試材料 轉基因油菜MON88302、轉基因油菜DP-073496-4、轉基因棉花MON88913、轉基因大豆A2704-12、轉基因大豆GTS 40-30-2、轉基因玉米MIR162、轉基因玉米MON810、轉基因玉米NK603、轉基因玉米BT11、轉基因甜菜H7-1、非轉基因大米和非轉基因棉花新陸早51 號。 供試材料為本實驗室購置保存；棉花內源基因棉花乙醇脫氫酶C 基因(AdhC 基因)(Mazzara，et al.，2007)和轉基因棉花MON88701 品系特異性片段雙基因陽性質粒樣品為本實驗室構建。

1.1.2 主要試劑 Primex Ex Taq(2×) for qPCR(大連寶生物)；DNA 提取試劑盒(北京天根公司)；終濃度10 μmol·L-1的引物和探針工作液(閃晶生物公司)。

1.1.3 主要儀器與設備 實時熒光定量PCR 儀ABI 7500、ABI 7500FAST(美國應用生物系統(tǒng)公司)；微滴式數字PCR 系統(tǒng)QX 200 (美國伯樂公司)；微量分光光度計nanodrop 2000c(美國Thermo公司)；研磨機(德國IKA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品基因組DNA 的提取與純化 稱取100 mg 研磨好的樣品，使用基因組DNA 提取試劑盒提取樣品中的基因組DNA，然后采用微量分光光度計測定提取基因組DNA 的濃度，最后將已測定好濃度的DNA 溶液置于-20 ℃條件下備用。

1.2.2 引物和探針設計 根據相關基因數據庫所述轉基因棉花MON88701 品系轉入的基因盒5′端與棉花基因組鄰接區(qū)序列，設計引物和探針通過Primer 5.0 軟件。 然后在NCBI 網站上將設計好的引物、探針通過Blast 比對，確定引物和探針的理論特異性；用棉花內源基因AdhC 對棉花來源樣品DNA 進行檢測。

1.2.3 實時熒光PCR 反應體系退火溫度及引物探針配比的優(yōu)化 采用寶生物酶系混合物推薦的引物探針比，采用不同體積的引物探針進行優(yōu)化。

A 組的擴增反應體系為：25 μL，包括Premix Ex TaqTM12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol·L-1檢測引物MON88701-F 和MON88701-R 各0.5 μL，10 μmol·L-1檢測探針MON88701-P 1 μL，34000 拷貝·μL-1DNA 模板(轉基因棉花MON88701品系基因組DNA)2 μL 和ddH2O 8.3 μL。

B 組的擴增反應體系為：25 μL，包括Premix Ex TaqTM12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol·L-1檢測引物MON88701-F 和MON88701-R 各0.4 μL，10 μmol·L-1檢測探針MON88701-P 0.8 μL，34000 拷貝·μL-1DNA 模板(轉基因棉花MON88701品系基因組DNA)2 μL 和ddH2O 8.7 μL。

C 組的擴增反應體系為：25 μL，包括Premix Ex TaqTM12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol·L-1檢測引物MON88701-F 和MON88701-R 各0.2 μL，10 μmol·L-1檢測探針MON88701-P 0.4 μL，34000 拷貝·μL-1DNA 模板(轉基因棉花MON88701品系基因組DNA)2 μL 和ddH2O 5.9 μL。

退火溫度分別設置為58、60 ℃，反應程序為95℃30 s，95 ℃5 s，58 ℃34 s，40 個循環(huán)，于58、60℃分別收集熒光信號。

1.2.4 實時熒光PCR 檢測方法的特異性 提取轉基因油菜MON88302、轉基因油菜DP-073496-4、轉基因棉花MON88913、轉基因大豆A2704-12、轉基因大豆GTS 40-30-2、轉基因玉米MON810、轉基因玉米BT11、轉基因玉米MIR162、轉基因玉米NK603、轉基因甜菜H7-1、非轉基因棉花的基因組DNA 為模板，陽性對照為Adhc-MON88701 質粒，陰性對照為非轉基因大米DNA。 通過己建立的轉基因棉花MON88701 品系特異性實時熒光PCR 檢測方法進行擴增， 對該檢測方法的特異性進行鑒定。

1.2.5 實時熒光PCR 方法的靈敏度及標準曲線建立 將提取的Adhc-MON88701 質粒DNA 稀釋后用微滴數字PCR 進行定量，然后用TE 緩沖液分別稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34 和17 拷貝·μL-1，進行線性范圍測試、可重復性測試和靈敏度檢測。 上述9 個濃度DNA 溶液進行實時熒光PCR 擴增，每個濃度3 個平行孔。

1.2.6 可重復性測試 對1.2.5 中倍比稀釋的DNA 溶液， 測定本實驗建立的方法的可重復性，并統(tǒng)計分析其標準偏差、相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR 檢測方法的建立與優(yōu)化

2.1.1 PCR 檢測方法的建立與優(yōu)化 該實驗設計的多對引物和探針，是通過分析轉基因棉花MON88701 品系轉入的基因盒5′端與棉花基因組鄰接區(qū)序列(圖1)，然后分析引物與探針的反應效率、擴增曲線和擴增效果，對引物和探針進行篩選，最終選擇MON8870-F/R/P 引物和探針建立轉基因棉花MON88701 品系特異性檢測方法，序列見表1。

2.1.2 PCR 反應體系退火溫度及引物探針配比優(yōu)化 退火溫度為58 ℃時(圖2)，從左到右分別為B、A 和C 組的擴增曲線，3 組均擴增良好，B 組Ct值最?。煌嘶饻囟葹?0 ℃時(圖3)，從左到右分別為A、B 和C 組的擴增曲線，3 組均可有效擴增，但Ct 值均比58 ℃時稍高，所以基于經濟性和擴增效率，考慮選擇58 ℃作為退火溫度、B 組引物探針配比為本研究的擴增反應體系比較合適。

圖1 MON88701 特異性序列Fig.1 Specfic sequence of MON88701

表1 實時熒光PCR 的引物、探針Table 1 Primers and probes for real-time fluorescent PCR

圖2 退火溫度為58 ℃時的擴增圖Fig.2 Amplification plots of A， B and C prime/probe group at 58 ℃

圖3 退火溫度為60 ℃時的擴增圖Fig.3 Amplification plots of A， B and C prime/probe group at 60 ℃

2.2 特異性測試

采用1.2.4 中14 種樣品的DNA 測定本實驗建立的轉基因棉花MON88701 品系特異性檢測方法的特異性，結果(圖4) 表明：采用轉基因棉花MON88701 品系特異性引物MON88701-F/R 和探針MON88701-P 進行實時熒光PCR 時，典型熒光擴增曲線的只有陽性樣品Adhc-MON88701，無典型曲線的均為其他農作物材料樣品，說明本實驗的檢測方法特異性良好。

圖4 MON88701 的特異性測試Fig.4 Specific test of MON88701

2.3 靈敏度測試

將提取的Adhc-MON88701 質粒DNA 溶液分別稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17 拷貝·μL-1共9 個濃度梯度進行檢測(圖5)。9 個濃度梯度均有典型擴增曲線，其最低檢測拷貝數為34 拷貝(25 μL 反應體系上樣量2 μL)。 擴增圖從左至右分別為340000～17 拷貝·μL-1擴增曲線。

2.4 制備標準曲線

利用2.3 中9 個濃度梯度DNA 作為模板，進行轉基因棉花MON88701 品系實時熒光PCR 檢測，建立轉基因棉花MON88701 品系特異性序列標準曲線(圖6)，以實現對轉基因棉花MON88701 品系的相對定量分析。 測試結果的Ct 值如表2 所示，根據表2 中的Ct 值數據與在34 ～680000 拷貝(25 μL 體系中上樣量為2 μL)范圍內9 個濃度的對數值與所得Ct 值建立標準曲線如圖6 所示，線性回歸方程為y=-3.48x+ 39.91，R2=0.99，擴增效率為94%(介于90% ～110%)，表明本實驗建立的MON88701 品系特異性實時熒光PCR 檢測方法在模板量34～680000 拷貝范圍內線性相關性良好，擴增效率高，符合ENGL(european network of gmo laboratories)相關要求(Grl-gmff，2009)；在模板量為34～680000 拷貝的線性范圍內，其Ct 值的SD 介于0.22～0.62，RSD 介于0.78%～2.90%，表明在線性范圍內最低模板量34 拷貝時，其SD 和RSD 均小于25%，所以確定本實驗的定量檢測下限為34 拷貝。

圖5 MON88701 的靈敏度測試Fig.5 Sensitivity test of MON88701

圖6 MON88701 實時熒光PCR 標準曲線Fig.6 Standard curve of real-time PCR method for MON88701

3 討論

為保證轉基因產品標簽制度順利實施，需要建立準確、穩(wěn)定的檢測方法來對轉基因作物進行有效鑒別(劉二龍等，2015)。 目前各國均研究和發(fā)展了一些基于不同技術平臺的轉基因檢測方法，其中以基于核酸基礎上的PCR 方法為主流(吳永彬等，2011)。 品系特異性實時熒光PCR 能對外源基因插入受體基因組位點的唯一性特征來設計引物探針進行檢測(Kluga et al.，2012)，具有特異、快速、高靈敏性和高能量等特點(Anklam et al.，2002)，因此是目前被廣泛認可和采用的一種檢測方法。 目前已有多種轉基因作物品系建立了實時熒光PCR 方法，如轉Bt 基因大米(吳孝橫等，2009)、轉基因玉米Bt176(李蔥蔥等，2007)、轉基因大豆(吳影等，2007)等。

表2 實時熒光PCR 方法的靈敏度及可重復性測試Table 2 Sensitivity and repeatability test of real-time fluorescent PCR method

本研究針對轉基因棉花MON88701 品系轉入的基因盒5′端與棉花基因組鄰接區(qū)序列來設計檢測引物和探針，建立轉基因棉花MON88701 品系特異性實時熒光PCR 檢測方法，最低定量檢測下限為34 拷貝，其擴增效率為94% (介于90% ～110%)，重復性實驗的SD 和RSD 均符合ENGL 要求，表明該方法具有良好的特異性、高靈敏度和穩(wěn)定性強的優(yōu)點，可應用于進出境口岸、農產品監(jiān)管中轉基因棉花MON88701 的檢測。