張靳宜， 呂寶乾 ， 楊 帆， 何 杏， 盧 輝， 唐繼洪， 梁文豪海南大學熱帶農林學院，海南 儋州57737；中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南 儋州57737

斜紋夜蛾Spodoptera litura (F.) 屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性的農業(yè)害蟲，是我國主要的農作物害蟲，在我國大部分省市均有分布，具有生殖能力大、寄主范圍廣且食量大的特點，常間歇性大暴發(fā)。 據(jù)報道，斜紋夜蛾的寄主已達109 科植物(秦厚國等，2006)。 目前，對斜紋夜蛾的防治仍以藥劑防治為主。 但是，化學藥劑的使用導致抗藥性的增強，同時對人畜安全及環(huán)境造成嚴重危害。 近年來，研究者從斜紋夜蛾病原微生物的角度來研究防治斜紋夜蛾的方法，發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾體內的病毒、細菌、真菌等病原微生物是調節(jié)斜紋夜蛾種群數(shù)量的重要因子(羅凱等，2015)。

昆蟲的腸道中有大量微生物，由于寄主腸道對寄生的微生物特異蛋白長期進行作用選擇，所以菌群與腸道一起協(xié)同發(fā)育、相互影響。 因此，即使同一動物的不同發(fā)育歷期、不同腸道部位，其體內的腸道微生物也會出現(xiàn)種類和數(shù)量的差異(Priya et al.，2012)。 腸道菌群在抵御外來病原或者毒劑時，能保持原有數(shù)量以維持內環(huán)境穩(wěn)定，并且通過刺激產生代謝物質、增加腸道上皮細胞，以促進寄主的免疫系統(tǒng)進一步進化(張振宇等，2017)。 斜紋夜蛾腸道微生物組介導殺蟲劑的抗藥性已逐步開始研究。 如Gadad ＆ Vastrad (2016)用抗生素清除斜紋夜蛾的腸道微生物后，斜紋夜蛾對農藥的抗性降低，而具有正常腸道菌的斜紋夜蛾對農藥的抗性則相對較高，說明斜紋夜蛾的腸道微生物能夠介導宿主對農藥的抗性；Thakur et al. (2015)利用硫酸鏈霉素(streptomycinsulphate)飼喂斜紋夜蛾，改變了其腸道微生物的組成，導致其腸道消化酶活力升高，解毒酶活力降低，該抗生素處理加快了幼蟲生長，但并不影響存活率。 這些研究均表明，斜紋夜蛾的腸道微生物可能對宿主產生重要的作用。

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(以下簡稱甲維鹽)是一種高效、低毒、低殘留的十六元大環(huán)內酯類殺蟲劑。 由于其獨特的作用方式，且對鱗翅目害蟲幼蟲表現(xiàn)出較好的毒性，目前已成為我國廣泛使用的用來防治蔬菜害蟲的新型農藥(車矢男等，2018)。本研究通過對經甲維鹽處理后的斜紋夜蛾腸道微生物進行比對，研究腸道菌群受毒劑刺激后的代謝變化，探討菌株的自身代謝與甲維鹽的作用受體的相關性，為進一步解釋甲維鹽對斜紋夜蛾的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

斜紋夜蛾采自海南省儋州市農科基地實驗田，用蓖麻葉人工喂養(yǎng)4 代以上，生長溫度26 ～28 ℃，光周期L ∶D=12 h ∶12 h，相對濕度60%～80%。將待羽化的蛹成對放入養(yǎng)蟲籠內。 成蟲羽化后喂以10%的蜂蜜水，放入當?shù)匦迈r木瓜葉以供其產卵。 試蟲均為4 齡幼蟲。

1.2 樣品處理

以蒸餾水為對照，將未經處理的蓖麻葉從主莖剪開，在甲維鹽溶液中浸20 ～25 s 后取出，自然晾干，喂養(yǎng)2 d 后，挑出未死的幼蟲。 將上述幼蟲以5頭一組，在0～4 ℃的冰箱中進行5 ～6 h 饑餓處理。先用預冷的70%的酒精和2%NaClO 進行體表消毒，然后迅速用0.15 mo1·L-1的NaCl 溶液漂洗3次，再放在冰塊上截取中腸，去除表面雜質及其內含物，加入含pH7 的磷酸緩沖液的微量離心管(1.5 mL)內，在保持低溫狀態(tài)下勻漿。 實驗重復3 次，記為J1、J2、J3。 食用未經毒劑處理葉片的幼蟲也進行相同處理，分別記為C1、C2、C3。 樣本放入于-20 ℃液氮罐中保存待研究。

1.3 DNA 抽提

根據(jù)E.Z.N.A.?soil 試劑盒說明書進行各個樣本總DNA 抽提，在NanoDrop 2000 上進行DNA 濃度檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA質量。

1.4 PCR 擴增和測序

采用通用引物(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和(TCCTCCGCTTATTGATATGC)對基因片段進行擴增。 反應總體系25 μL(PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 0.50 μL，引物各1.00 μL，Taq DNA polymerase 0.15 μL，模板DNA 2.00 μL，ddH2O 17.85 μL)，94 ℃預變性5.0 min，變性50 s；在45～60 ℃下退火50 s、72 ℃延伸10 min，27 個循環(huán)，最后產物于4 ℃保存。

在BIO-RAD 擴增儀上進行PCR 擴增，用2%瓊脂糖凝膠回收2 μL 的PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences， Union City， CA， USA)進行純化，Tris-HCl 洗脫，用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像儀上觀察并拍照。 利用QuantiFluorTM-ST (Promega， USA)進行檢測定量。 根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(Illumina，San Diego，USA)將純化后的擴增片段構建PE 2?300 的文庫。 在Miseq PE300 平臺進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將Illumina MiSeq 平臺測序上所得的raw reads中大于10 bp 的overlap 進行拼接，使用Trimmomatic 軟件質控過濾。 過濾后，在保留至少3 個樣本的前提下，將序列≥5 的物種(operatonal taxonomic unit，OTU)和序列綜合≥20 的OTU 按最小樣本序列數(shù)進行抽平處理，將具有高度相似性(97%)的序列歸為一個OTU 后進行分類學分析(表1)。 根據(jù)以上分類學信息進行ɑ-多樣性和樣品比較分析，以及處理前后的樣本組成及差異分析。

2 結果與分析

2.1 甲維鹽對斜紋夜蛾腸道菌群的結果分析

通過16S rRNA 基因測序以及ɑ-多樣性分析，得到userach 平臺的聚類劃分單元結果(圖1)。 在對照組(C 組)3 個樣本和處理組(J 組)的3 個樣本共有18 個OTU，隨著測序含量的增加，曲線由最開始的急增逐步趨于平緩，表明幼蟲腸道的菌群信息絕大多數(shù)被測得。 隨著測序量的增大，檢測到的物種不再增加，說明本次測序量充足，可以反映細菌的廣度，可完成后續(xù)分析。

表1 斜紋夜蛾腸道提取物測序OTU 表Table 1 OTU table of intestinal extracts from S. litura larvae

圖1 斜紋夜蛾腸道菌群測序序列香農指數(shù)Fig.1 Shannon index of sequence of intestinal flora of S. litura

2.2 物種組成分析

2.2.1 從OTU 的變化看 基于各個樣本中的OTU數(shù)，用MO-THUR 軟件中的韋恩命令對菌群多樣性進行分析并做出Venn 圖(圖2A)。 僅從細菌的多樣性角度對6 個樣本進行定性分析，幼蟲腸道菌群在藥劑處理后仍然具有相對的保守性。 幼蟲的腸道樣本文庫共有的18 個OTUs 中，處理過后共同的OTUs 有14 個，占兩者總值的77.8%，14 個OTU 占有不同的比例(圖2B)。 說明甲維鹽處理后，蟲體在未死的狀態(tài)下，仍然保證了其腸道內容物的完整性。 而變化的腸道菌可能是導致甲維鹽作用的關鍵菌群。 同時可看出，本地區(qū)斜紋夜蛾對于微量阿維菌素類藥劑不敏感。

2.2.2 從屬的組成角度看 如圖3 所示，從屬的角度看，C 組中腸桿菌屬Enterobacter、根瘤菌屬Rhizobium 占絕對優(yōu)勢，J 組以棒狀桿菌屬Corynebacterium、甲醇桿菌屬Methylobacterium 為優(yōu)勢菌群。 C組中沙雷氏菌屬Serratia 和黃單胞桿菌屬Xanthomonas 在處理后幾乎為零。 從整體上看，C 組和J 組共有10 個不同的屬，藥劑處理后，細菌的豐富度下降可能與甲維鹽直接殺死細菌或間接干擾細菌的正常代謝通路有關。 而豐度上升的棒狀桿菌屬、甲醇桿菌屬則有可能與甲維鹽的毒理機制關系密切。 腸桿菌屬在腸道環(huán)境變化前后都占有很大的比例，說明該菌對斜紋夜蛾的生理的影響極大。

圖2 對照組(C 組)和處理組(J 組)的差異Fig.2 Difference between control group (group C) and treatment group (group J)

圖3 2 組樣本屬水平上的細菌豐度圖Fig.3 The abundance of bacteria at the genus level of two samples

2.3 2 樣本比較與差異分析

2.3.1 組間差異 通過R 語言統(tǒng)計分析和作圖，基于PCoA 的圖像的差異離散情況，分析甲維鹽處理前后2 組的細菌群落組成(圖4)。 結果表明，對照組C 和處理組J 物種組成有差異。

圖4 2 組樣本在屬的水平上的差異分析Fig.4 Analysis of differences between two groups of samples at the generic level

2.3.2 2 組樣品細菌種類分析 利用stamp 軟件，通過student′s 檢驗(P＜0.05)，對2 組樣品進行屬的水平上的差異分析。 結果表明，J 組的棒狀桿菌屬豐度顯著高于對照組(??P＜0.01 和?P＜0.05)，說明棒狀桿菌的異常增多可能是由于甲維鹽在發(fā)揮作用(圖5)。

3 討論

近年來，由于高通量測序技術突破了傳統(tǒng)生物分離培養(yǎng)中的諸多限制，如可分離菌量有限、人為操作次數(shù)過多導致誤差增大等，使其在研究和判斷微生物群落中得到了廣泛應用。 孫博通等(2017)利用傳統(tǒng)微生物分離純培養(yǎng)方法從斜紋夜蛾4 齡幼蟲腸道中共分離鑒定得到10 株細菌，其中，變形菌門和厚壁菌門是斜紋夜蛾腸道可培養(yǎng)細菌中的優(yōu)勢菌群。 功能驗證實驗表明腸桿菌具備纖維素降解能力，微桿菌具備很強的苯酚降解能力。 唐帥等(2016)通過分離蜻蜓和白蟻等昆蟲腸道，發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌菌株。 它可以經發(fā)酵可以產生γ-氨基丁酸(GABA)，GABA 也是蟲體內重要的神經抑制性遞質，說明特定昆蟲腸道體內的共生菌群可能通過在體內產生酶類物質或者次生代謝物的方式，介導產生神經性遞質。 本研究表明，甲維鹽處理斜紋夜蛾后的桿菌的物種豐度明顯提高。 這可能是由于某種桿菌的豐度大幅上升導致桿菌的代謝產物和GABA 的含量也隨之增加，而GABA 恰好為甲維鹽的作用受體(畢富春，2003)，這一抑制性神經受體的含量增加可以導致害蟲逐漸喪失生理活動的積極性，從而產生毒性反應。 同時，豐度明顯減少的原優(yōu)勢菌群腸桿菌屬在腸道環(huán)境變化后仍然占據(jù)很大的比例，說明該屬的組成種類的代謝對夜蛾的生理的影響極大(劉小改，2016)。

圖5 2 組樣本組間具體屬的差異分析Fig.5 Analysis of the difference of specific genera between the two groups

腸桿菌屬是廣泛存在于昆蟲腸道中的菌體，如在實蠅中，益生菌被開發(fā)應用于實蠅的生物防治，完善并提高了SIT 的高效和經濟性，同時在實蠅代謝生長、抵抗外來病原菌入侵方面都發(fā)揮了重要的作用(姚明燕等，2017)。 同樣大幅下降的根瘤菌屬具有代謝產生分解纖維素的能力，所以在植食性昆蟲的腸道中廣泛存在，如葉峰(張帥帥，2017)、桃蛀螟、松墨天牛和金龜?shù)取?經藥劑處理后的斜紋夜蛾的生理代謝和食欲下降也極有可能是因為根瘤菌屬的下降導致其代謝不了蓖麻葉的纖維和果膠所致。 沙雷氏菌屬在歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae 萜烯化合物的毒性反應中發(fā)揮了重要作用，在本實驗中其數(shù)量幾乎減小至無，可能是由于對十六元大環(huán)內脂的活力沒有解毒作用，也沒有適應能力，而被殺蟲劑殺死；同時據(jù)相關研究，該菌還有分解纖維素的能力(Arku，2017)，與處理后斜紋夜蛾食欲下降的實驗現(xiàn)象相符，所以該菌可能起到了使夜蛾避食的效力。 用Bt 殺蟲劑處理后，甲醇桿菌屬和棒狀桿菌屬一起增加(李振等，2016)，可能是這類菌更加適合變化后的腸道環(huán)境，也有可能參與了蟲體內部的自身免疫反應，導致其活性增加。

綜上，斜紋夜蛾變化的腸道菌群在經甲維鹽處理后，可能通過干擾內部腸道菌群的代謝而產生相應的效力，但該效應是否與甲維鹽的作用受體GABA 有關、斜紋夜蛾的抗藥性的產生和腸道菌群代謝關系還需要進一步的研究。