胡尊紅，王沛琦，楊 謹(jǐn)，胡學(xué)禮，劉旭云

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南昆明650205）

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科紅花屬的一年生雙子葉草本植物，別名草紅花、菊紅花等，是一種花、油兩用以及栽培歷史悠久的經(jīng)濟(jì)作物[1]。紅花花瓣作為提取天然黃、紅花色素的原料和中藥材使用。常見(jiàn)的紅花為不帶子房的管狀干燥花，味辛、性溫[2]。紅花的主要藥用活性成分為羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA），具有活血化瘀，通經(jīng)止痛之功效，常用來(lái)治療血脈閉塞、心絞痛和冠心病等疾病[3-4]。紅花種子可以榨油，富含不飽和脂肪酸，多為高檔烹飪食用油。紅花起源于大西洋東部、非洲西北部及地中海沿岸[5]。我國(guó)紅花栽培歷史悠久，主要分布西北、中原及西南地區(qū)，其中，新疆種植面積最大，其已成為西北地區(qū)春播和西南地區(qū)秋播的優(yōu)勢(shì)作物[6]。從20 世紀(jì)90 年起，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所就從事紅花種質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)和利用等工作，選育云紅一號(hào)、云紅二號(hào)和云紅三號(hào)等云紅花系列新品種，也稱(chēng)滇紅花，在全國(guó)范圍內(nèi)種植面積廣泛，產(chǎn)量高、品質(zhì)好，受全國(guó)各地農(nóng)戶(hù)青睞[7]。

目前，紅花的研究主要集中在紅花化學(xué)成分[8-9]、藥理作用[10-12]及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[13-14]、新品種選育[15-16]等方面。雖然云南紅花種質(zhì)資源在相關(guān)文獻(xiàn)已有報(bào)道[17-19]，但多集中在農(nóng)藝性狀上的表型差異。少數(shù)、零星云南紅花種質(zhì)也通過(guò)SRAP、SSR 和AFLP 標(biāo)記進(jìn)行了遺傳多樣性評(píng)價(jià)，但云南地形錯(cuò)綜復(fù)雜，氣候類(lèi)型迥異，形成云南獨(dú)特的紅花種質(zhì)，其分布廣泛、表型多樣，類(lèi)型豐富[20]。因此，多樣本、多類(lèi)型及多方面比較才能全面、準(zhǔn)確反映云南紅花種質(zhì)遺傳多樣性。

本研究從560 份紅花種質(zhì)資源中通過(guò)表型多樣性分析，篩選出50 份優(yōu)異種質(zhì)，擬通過(guò)AFLP 標(biāo)記對(duì)云南紅花種質(zhì)的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)比較進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為云南紅花種質(zhì)資源收集、保護(hù)以及紅花新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試紅花材料是云南省不同類(lèi)型的種質(zhì)資源群體材料，采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所紅花種質(zhì)資源圃（表1）。

表1 供試紅花種質(zhì)資源材料

續(xù)表1

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

AFLP 分析試驗(yàn)主要是在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所用的主要儀器有DNA 擴(kuò)增儀（Bio-Rad 9700，美國(guó)），紫外凝膠成像儀（Bio-Rad UVP GDS-8000，美國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（Hermle Labortechnlk，德國(guó)），多用電泳儀電源（DYY-12C，北京），測(cè)序電泳儀（JUNYI，北京），純水儀（Aquapro，重慶），紫外分光光度計(jì)（UV-7504，上海）。

主要試劑為T(mén)aq DNA 聚合酶、T4 DNA Ligase、EcoR I 限制性?xún)?nèi)切酶和Mse I 限制性?xún)?nèi)切酶，均購(gòu)自 Ferments 公 司；RNase、dNTP、ATP、TEMED、Acrylamide、Bis-acrilamide 購(gòu)自Sigma 公司；Mse I adapter 和EcoR I adapter 和AFLP 引物由上海生工公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅花DNA 的提取 其在傳統(tǒng)CTAB 法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[21]。針對(duì)紅花組織中含酚類(lèi)物質(zhì)、多糖、單寧物質(zhì)等較高的特點(diǎn)，添加不同的抗酚類(lèi)氧化褐變物質(zhì)，防止DNA 褐化。苗期隨機(jī)選取紅花各10 株，每株取1～2 片葉片構(gòu)成試驗(yàn)材料混合DNA 池，用于提取DNA。

1.3.2 紅花AFLP 分析 其參照VOS 等[22]、胡尊紅等[23]的方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

1.3.2.1 紅花模板DNA酶切和連接 其采用EcoR I、Mse I 限制性?xún)?nèi)切酶的雙酶切體系進(jìn)行。15 μL 的雙酶切體系：DNA 200 ng；EcoR I（10 U/μL）2 μL；Mse I（5 U/μL）0.2 μL；TangoTMbuffer 3.0 μL；加水至15 μL。37℃保溫4h，65℃保溫3h，80℃滅活10min。

15 μL 連接體系：酶切產(chǎn)物5.0 μL；EcoRⅠadapter（5 pmol/μL）1.0 μL；MseⅠadapter（50 pmol/μL）1.0 μL；10×buffer 2.0 μL；T4 連接酶（5 U/μL）0.4 μL；加水至15 μL。22 ℃過(guò)夜（10～12 h）。連接完成后，65 ℃滅酶活。反應(yīng)完成后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2.2 預(yù)擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)增選用（E＋0）/（M＋0）引物組合進(jìn)行。20 μL 的預(yù)擴(kuò)增體系：連接產(chǎn)物4.0 μL；E（A）（10 μmol/μL）1.0 μL；M（C）（10 μmol/μL）1.0 μL；10×buffer 2.0 μL；Mg2+（25 mmol/μL）1.2 μL；dNTP（10 mmol/μL）0.4 μL；Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL；加水至20 μL。94 ℃3 min；94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋20 倍。

1.3.2.3 選擇性擴(kuò)增 選用（E＋3）/（M＋3）或（M＋4）引物組合（表2）進(jìn)行。20 μL 的選擇性擴(kuò)增體系：預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物4.0 μL，10×buffer 2.0 μL，Mg2+（25 mmol/μL）1.2 μL，dNTP（10 mmol/μL）0.4 μL，Taq 酶1 U，引物（10 μmol/μL）各1.0 μL，加水至20 μL。

表2 AFLP 選擇性擴(kuò)增引物

反應(yīng)體系為：94 ℃3 min；94 ℃30 s，65 ℃45 s，72 ℃1 min，10 個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降7 ℃；再94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃1 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

1.3.2.4 引物的篩選 根據(jù)AFLP 分子標(biāo)記研究紅花屬植物的相關(guān)文獻(xiàn)，從常用的64 對(duì)AFLP 選擇性擴(kuò)增引物中篩選引物，先用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，淘汰部分?jǐn)U增效果差或無(wú)擴(kuò)增條帶的引物，再依據(jù)聚丙烯凝膠電泳篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的引物用于正式試驗(yàn)。

1.3.2.5 銀染 將玻璃板放入純水中，清洗1 min；然后將玻璃板放入新配制的0.2%AgNO3染色液中，輕搖10～20 min。將染色后的膠板放入純水中5～10 s，迅速取出并豎起控水；然后把膠板放入新配好的顯影液（8 g NaOH，6.4 mL 甲醛，加水至1.6 mL）中，輕搖振蕩，直至條帶出現(xiàn)。用純水清洗2 次，每次1 min，然后豎起晾干。

1.4 數(shù)據(jù)分析

AFLP 擴(kuò)增產(chǎn)物在相同水平遷移位置的以0，1統(tǒng)計(jì)，并建立由“0，1”組成的AFLP 原始數(shù)據(jù)的二元矩陣。使用NTSYSpc 2.2 計(jì)算Jaccard 遺傳相似系數(shù)。運(yùn)用SHAN 程序，構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。使用POPGEN 3.2 軟件分析標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性條帶百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)Ne、多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）、Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)以及Nei 遺傳距離和遺傳一致度。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性分析

在AFLP 引物多態(tài)性分析中，從102 對(duì)引物中篩選出8 對(duì)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物組合，共擴(kuò)增331 條帶，142 條多態(tài)性帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多集中100～800 bp，多態(tài)性比率為33.42%～55.80%，平均多態(tài)性為42.42%（表3）。說(shuō)明AFLP 標(biāo)記技術(shù)能很好地揭示云南優(yōu)異紅花種質(zhì)的多態(tài)性，為后續(xù)分析遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

表3 8 對(duì)引物組合在紅花AFLP 分析中的多態(tài)性比較

2.2 UPGMA 聚類(lèi)分析

采用NTSYS 2.0 軟件對(duì)AFLP 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由圖1 可知，50 份紅花優(yōu)異種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.56～0.99，說(shuō)明這些云南紅花種質(zhì)資源在種內(nèi)具有很大的遺傳分化；同時(shí)在相似系數(shù)0.64～0.66把所有紅花材料可分為4 個(gè)組：Ⅰ組包括YnHF-1，YnHF-12，YnHF-43，YnHF-42，YnHF-14，YnHF-2，YnHF-5，YnHF-13，YnHF-4，YnHF-8，YnHF-36，YnHF-44，YnHF-40，YnHF-45，YnHF-3，YnHF-7，YnHF-30；Ⅱ組包括YnHF-9，YnHF-10，YnHF-25，YnHF-27，YnHF-28，YnHF-29，YnHF-35，YnHF-20，YnHF-21，YnHF-41，YnHF-50，YnF-22，YnHF-31，YnHF-37，YnHF-39；Ⅲ組包括YnHF-49，YnHF-11，YnHF-17，YnHF-23，YnHF-24，YnHF-16，YnHF-26，YnHF-18，YnHF-32YnHF-33，YnHF-47，YnHF-15，YnHF-19；Ⅳ組包括YnHF-6，YnHF-34，YnHF-38，YnHF-46。聚類(lèi)結(jié)果表明，50 份材料并沒(méi)有以傳統(tǒng)表型而聚在一起，而是分成了4 個(gè)組。

2.3 遺傳分化與結(jié)構(gòu)分析

紅花群體遺傳分化分析結(jié)果如表4 所示，所有群體的總基因多態(tài)性（Ht）為0.283 3，群體內(nèi)基因多態(tài)性（Hs）為0.157 4，證明群體內(nèi)的分化較大。群體間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.444 5，說(shuō)明群體間的變異有44.45%來(lái)自不同群體間的差異；總的基因流（Nm）為0.624 8，說(shuō)明群體內(nèi)的基因流動(dòng)性較大。

表4 6 個(gè)群體內(nèi)的基因多樣性和基因流

群體間遺傳分化分析結(jié)果如表5 所示，50 份紅花材料分成6 個(gè)群體，各群體間的遺傳一致度在0.747 9～0.909 0，其中，條紋殼群體和抗銹病群體間具有最高的一致度，為0.909 0；無(wú)刺群體與黃花群體間的遺傳一致度次之，為0.886 7，黃花群體和大粒群體的遺傳一致度最低，為0.747 9。

表5 6 個(gè)紅花群體間遺傳相似性和遺傳距離

2.4 遺傳多樣性分析

由表6 可知，50 份紅花材料的6 個(gè)群體共擴(kuò)增出120 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占總位點(diǎn)的80%，其中，紅花條紋殼群體、抗銹病群體和無(wú)刺群體的多態(tài)性位點(diǎn)比率分別為67.50%，57.50%和55.00%。3 個(gè)種群的等位基因觀察數(shù)（Na）分布在1.250 0～1.675 0，全部群體則達(dá)到了1.800 0；有效等位基因數(shù)（Ne）分布在1.120 4 ～1.426 9，全部群體則達(dá)到了1.433 4。Nei 基因多樣性指數(shù)分布在0.077 1～0.251 3，其值由大到小順序?yàn)闂l紋殼群體＞高亞油酸群體＞抗銹病群體＞無(wú)刺群體＞大粒群體＞黃花群體；Shannon 指數(shù)分布在0.120 0～0.373 8，其值由大到小為條紋殼群體＞抗銹病群體＞高亞油酸群體＞無(wú)刺群體＞大粒群體＞黃花群體。說(shuō)明紅花條紋殼群體內(nèi)的變異最大，其次為抗銹病群體，黃花群體變異最小。

表6 基于AFLP 數(shù)據(jù)的6 個(gè)紅花群體的遺傳多樣性

3 結(jié)論與討論

紅花藥用品質(zhì)主要受紅花種質(zhì)資源的影響，種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是種質(zhì)資源利用的基礎(chǔ)[24]。遺傳多樣性最直接的表現(xiàn)形式是遺傳變異水平的高低，包括種群的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)[25]。分析不同類(lèi)型紅花種質(zhì)的遺傳差異，可為云南紅花種質(zhì)資源保護(hù)、高產(chǎn)以及優(yōu)質(zhì)紅花新品種的選育、紅花種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)[26]。20 世紀(jì)80 年代初，有研究報(bào)道，菊科紅花在自然狀態(tài)下以自花授粉為主，但蜜蜂也可成為紅花的傳粉昆蟲(chóng)，異交率可達(dá)40%以上[27]。本研究中，根據(jù)UPGMA 聚類(lèi)分析，遺傳相似系數(shù)為0.64～0.66，把50 份紅花材料分為4 個(gè)組，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)略有不同；同時(shí)進(jìn)行遺傳分化和群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)為0.444 5，總基因流為0.624 8，說(shuō)明紅花種內(nèi)的變異較大，種內(nèi)的基因流動(dòng)較大，不同類(lèi)型紅花種質(zhì)群體內(nèi)及群體間的基因多態(tài)性、遺傳分化、基因流等信息均存在較大差異，這與BARATI等[28]和DWIVEDIT 等[29]的研究結(jié)果類(lèi)似。因此，可以說(shuō)明育種材料之間的基因交流情況揭示育種材料內(nèi)部的遺傳分化，能夠有效地幫助紅花育種工作者更方便、準(zhǔn)確地了解和掌握紅花種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系。在將來(lái)育種工作中，研究人員要注意加強(qiáng)紅花種質(zhì)資源的交流，提高種質(zhì)資源的遺傳多樣性，擴(kuò)充我國(guó)紅花育種的種質(zhì)基因庫(kù)，為培育紅花雜交親本選擇及新品種選育奠定基礎(chǔ)。

菊科紅花在云南稱(chēng)滇紅花，為云南省道地藥材之一，產(chǎn)區(qū)主要為低海拔低緯度干熱河谷地區(qū)，栽培類(lèi)型多種多樣，但產(chǎn)區(qū)間相互引種頻繁，因此，聚類(lèi)結(jié)果與前期研究表型聚類(lèi)分析、地理區(qū)域劃分結(jié)果并不一致，略有差別。本研究利用AFLP 標(biāo)記對(duì)50 份云南紅花種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行分析，揭示了云南紅花種質(zhì)資群體遺傳信息以及群體間的基因滲透，對(duì)將來(lái)紅花育種、親本選擇具有一定的指導(dǎo)意義。