魏克強(qiáng)，郭婷婷，宋 欣，龐勝喜

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.保定幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河北涿州072750；3.山西大地環(huán)境投資控股有限公司，山西太原030032）

近年來，我國(guó)土壤重金屬鎘的污染狀況日趨嚴(yán)峻，對(duì)生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全造成了嚴(yán)重威脅。鎘是植物生長(zhǎng)的非必需元素，其移動(dòng)性大、生物毒性強(qiáng)，且易被吸收、富集。利用某些植物能夠耐受鎘毒害和超量積累的特性清除環(huán)境鎘污染的技術(shù)即植物修復(fù)，是實(shí)現(xiàn)土壤污染治理與生態(tài)修復(fù)的有效策略。但目前可利用的野生物種極其有限，人工培育出的優(yōu)良品種更是屈指可數(shù)[1-2]。植物提取是目前研究最多的一種植物修復(fù)技術(shù)，而篩選、培育超積累植物已成為當(dāng)務(wù)之急[3]。

唇形科羅勒屬（Ocimum）草本植物的分布廣泛、遺傳多樣性豐富，常作為觀賞、醫(yī)藥、工業(yè)等多種用途的芳香植物而栽培[4]。近年來發(fā)現(xiàn)，其某些野生種對(duì)重金屬的耐受和富集能力較強(qiáng)，是一種潛在的鎘超積累植物[5-7]。但在嚴(yán)重污染的土壤，羅勒生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、生物量低，實(shí)際應(yīng)用存在較大的局限性。相對(duì)于超積累植物，一些具有適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)周期短、生物量高、富集能力強(qiáng)、抗逆性好等優(yōu)點(diǎn)的作物表現(xiàn)出了較高的修復(fù)潛力，其中，煙草是比較理想的物種之一[8-9]。

栽培煙草（Nicotiana tabacum L.）極易將吸收的鎘富集在葉片（富集系數(shù)可達(dá)5～10），但它還不是超積累植物[10-11]。國(guó)內(nèi)外利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良煙草植株攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、耐受和積累重金屬的特性已有大量的研究[12]。遠(yuǎn)緣雜交可以促進(jìn)遠(yuǎn)緣物種間的基因漸滲、交流和重組，是將不同生物類型的優(yōu)良性狀結(jié)合起來創(chuàng)造變異、形成新物種和新類型的重要手段，這為利用野生超積累植物的基因資源創(chuàng)制修復(fù)污染土壤的煙草新種質(zhì)提供了可能[13-14]。

本研究以親本普通煙草78-04、羅勒（Ocimum basilicum L.）及其F2為材料，采用水培法初步分析了導(dǎo)入野生羅勒基因的煙草植株對(duì)鎘脅迫的耐受性與生理響應(yīng)，旨在為進(jìn)一步挖掘和利用基因資源開展植物修復(fù)的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生羅勒（Ocimum basilicum L.），種子采自山西省晉中市某鋼鐵冶煉廠附近，自然晾干后保存；普通煙草（Nicotiana tabacum）栽培品種78-04，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室提供；參考WEI 等[13-14]的方法，獲得（（Nicotiana sylvestris＋78-04）×Ocimum basilicum）雜交組合的F2材料。

1.2 試驗(yàn)方法

選取籽粒飽滿的各試驗(yàn)種子，以3%NaClO 浸泡消毒10 min，再以蒸餾水反復(fù)沖洗3～5 次后，分別播種于裝滿珍珠巖的發(fā)芽皿中出苗。待長(zhǎng)至4 葉期，移入水培箱進(jìn)行Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液（購(gòu)自海博生物公司，青島）培養(yǎng)。每個(gè)水培箱在鋪設(shè)的泡沫板上打6 個(gè)孔，每個(gè)孔移栽1 棵幼苗，室溫（26±2）℃，光照16 h/d，緩苗7 d 后進(jìn)行鎘脅迫試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)[14-15]的方法，在預(yù)試驗(yàn)中先設(shè)置5 個(gè)濃度的鎘（0，50，100，200，300 μmol/L CdCl2）持續(xù)處理10 d，以對(duì)照組（0 μmol/L）為參照，2 個(gè)親本材料間做對(duì)比，選出毒性癥狀差異明顯的1 個(gè)最大濃度（300 μmol/L）作為本試驗(yàn)的染毒濃度。然后選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的親本幼苗，分別移栽到含300 μmol/LCdCl2的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)不添加鎘的對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3 次。鎘以CdCl2·2.5H2O（分析純）加入營(yíng)養(yǎng)液中，每2 d 更換一次新鮮培養(yǎng)液，以HCl 或NaOH 調(diào)pH 值，使pH值在6.0 左右。F2種子播種、育苗、移栽、染毒等過程以及營(yíng)養(yǎng)液配制同上，僅設(shè)300 μmol/L CdCl2的處理組。染毒10 d 后，各處理組嚴(yán)格選取正常生長(zhǎng)、無明顯中毒癥狀的植株待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

按常規(guī)方法用直尺測(cè)量各植株的根長(zhǎng)和株高。將采集的各植株用自來水洗凈，再以去離子水沖洗，用吸水紙將表面水分吸干后分為根和莖葉2 個(gè)部分，稱鮮質(zhì)量；將78-04 和羅勒的各組織置于105 ℃殺青30 min，70 ℃烘至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量后粉碎過篩，HNO3-HClO4（體積比為4∶1）消化，原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鎘含量。

富集系數(shù)（BCF）＝植株組織中Cd 含量/培養(yǎng)液中Cd 含量 （1）

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）＝植株地上部Cd 含量/植株根部Cd 含量 （2）

取各植株的新鮮葉片0.5 g，置于預(yù)冷的研缽中，加入50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 值7.0）5 mL在冰浴中研磨，4 ℃12 000 r/min 離心20 min，取上清待用。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測(cè)定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；脯氨酸（PRO）含量采用酸性茚三酮比色法測(cè)定[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007 軟件；用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本幼苗耐受與富集鎘的差異分析

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（0 μmol/L CdCl2）相比，50～100 μmol/L CdCl2脅迫對(duì)78-04 煙草與野生羅勒幼苗的正常生長(zhǎng)發(fā)育沒有任何影響；當(dāng)鎘濃度增至200 μmol/L時(shí)，僅煙草植株呈現(xiàn)出新葉黃化的輕微毒性癥狀，去除重金屬后仍能正常生長(zhǎng)。即使在300 μmol/L CdCl2的脅迫下，羅勒幼苗也能正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐受能力；而部分78-04 煙草的葉片嚴(yán)重卷曲、變黃，根、莖生長(zhǎng)緩慢，植株萎蔫、失綠，鎘去除后幾乎不能恢復(fù)生長(zhǎng)。進(jìn)一步分析表明，野生羅勒與78-04 煙草對(duì)鎘的積累量、富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)也存在明顯的差異（P＜0.05）（圖1）。

2.2 對(duì)鎘脅迫耐受與生理響應(yīng)的差異分析

將部分F2種子（120 粒）播種后，其發(fā)芽率可達(dá)93.3%，以300 μmol/L CdCl2對(duì)112 株幼苗染毒后，以株高、根長(zhǎng)、生物量（鮮質(zhì)量）為指標(biāo)觀測(cè)幼苗的生長(zhǎng)表型。結(jié)果顯示，在鎘脅迫下，F(xiàn)2分離成2 個(gè)明顯的類群：強(qiáng)耐受型和弱耐受型；其中，108 個(gè)植株對(duì)該濃度的毒性非常敏感，呈現(xiàn)出典型的中毒癥狀甚至死亡，但仍有4 個(gè)單株對(duì)高濃度的鎘極不敏感，其根、莖、葉均未見明顯的毒害癥狀，且各單株的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量等性狀優(yōu)于親本植株（P＜0.05）（表1）。

表1 鎘脅迫對(duì)親本及其F2 生長(zhǎng)的影響

植物能夠通過多種解毒機(jī)制耐受鎘的毒性，抗氧化和滲透調(diào)節(jié)是有效的策略之一，MDA 與PRO含量以及SOD 與POD 活性是反映植物抵抗鎘脅迫能力的敏感指標(biāo)。結(jié)果表明，親本煙草與羅勒對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)具有明顯的物種間差異（P＜0.05）；與親本比較，F(xiàn)2優(yōu)良單株的SOD、POD 活性和PRO 含量的變化顯著（P＜0.05），其平均值分別為10.59，16.15 U/mg 和7.49 μg/g，變幅分別 達(dá)5.85～18.42，9.25～22.24 U/mg及4.35～11.83 μg/g（圖2）。

3 討論

為提高煙草耐受與富集重金屬的性狀，國(guó)內(nèi)外大多采取轉(zhuǎn)基因技術(shù)[12]，但目前對(duì)羅勒的相關(guān)基因及其編碼蛋白的功能還不清楚。由于受生物種繁殖隔離機(jī)制的影響，2 個(gè)遠(yuǎn)緣物種間的雜交往往難以獲得成功[17]?；谥参镄迯?fù)的目的，無論是煙草屬品種間、種間還是遠(yuǎn)緣物種間的雜交育種研究，國(guó)內(nèi)外還鮮見報(bào)道。植物的高產(chǎn)性狀是由多基因控制的性狀，對(duì)其改良的難度極大；而重金屬超積累性狀可能只是由少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵基因控制的，那么就有可能利用這些基因?qū)Ω呱锪康闹参镞M(jìn)行改良[18-21]，這有望選育出修復(fù)污染土壤的有價(jià)值的新材料。

利用植物凈化污染土壤的功效取決于植物吸收和向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力以及對(duì)所富集重金屬的耐受與解毒能力。通常植物對(duì)鎘吸收、積累和耐受的特性是受遺傳因素嚴(yán)格控制的，且在不同物種、不同基因型和不同品種間存在明顯差異[11，22]。研究發(fā)現(xiàn)，在水培條件下，羅勒（Ocimum basilicum）與印度芥菜（Brassica juncea）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、天藍(lán)遏藍(lán)菜（Thlaspi caerulescens）、紫羊茅（Festuca rubra）等超富集植物的地上部鎘含量相似；在污染的土壤，其鎘的累積量高于生物量大的作物玉米（Zea mays）。丁香羅勒（Ocimum gratissimum）的鎘累積能力還與蕹菜（Ipomoea aquatica）、蕪箐（Brassica rapa）等近似，莖葉的累積量超過100 mg/kg[5-7，11-12]。本試驗(yàn)采集的野生羅勒也能夠在污染土壤中旺盛生長(zhǎng)卻未表現(xiàn)出毒害癥狀，可能與其長(zhǎng)期適應(yīng)生存環(huán)境所形成的特殊機(jī)制有關(guān)。

鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)遲緩、葉片褪綠、生物量顯著降低甚至死亡等毒性效應(yīng)，根長(zhǎng)、生物量的變化能夠直接反映植物對(duì)鎘的耐受性[23]。鎘脅迫誘發(fā)的活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除的失衡，進(jìn)而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、生物大分子損傷，被認(rèn)為是鎘產(chǎn)生毒害作用的主要機(jī)制之一。植物會(huì)啟動(dòng)抗氧化保護(hù)和滲透調(diào)節(jié)等防御機(jī)制來避免或減輕氧化損傷，維持植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育[23]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）是植物清除活性氧自由基最主要的抗氧化酶，SOD 將O2-還原成H2O2，POD 再將細(xì)胞內(nèi)過量的H2O2迅速分解為H2O 和O2，以防止細(xì)胞膜脂過氧化；MDA 是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低是衡量細(xì)胞自由基代謝水平和氧化損傷程度的敏感指標(biāo)。脯氨酸（PRO）是水溶性最大的氨基酸，在維持細(xì)胞滲透壓、清除活性氧自由基等方面發(fā)揮著重要作用，其積累可能是植物受到逆境脅迫的一種信號(hào)[24]。

本研究顯示，親本野生羅勒符合鎘超積累植物的典型特征：地上部（莖和葉）的鎘含量達(dá)到了臨界含量標(biāo)準(zhǔn)（100 mg/kg），其富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）均大于1。與親本栽培煙草相比，F(xiàn)2優(yōu)良單株通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的水平來避免或緩解毒性鎘脅迫導(dǎo)致的毒性作用，顯示出了較強(qiáng)的耐受性。目前對(duì)導(dǎo)致這些差異的分子機(jī)制還不清楚，可能與導(dǎo)入野生羅勒基因產(chǎn)生了新的性狀有關(guān)，這對(duì)挖掘和利用野生超積累植物蘊(yùn)藏的基因資源進(jìn)行植物修復(fù)研究具有重要的價(jià)值。