閆志鵬，儀慧蘭，張艾英，郭二虎

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所，山西長治046011）

谷子（Setaria italica（L.）Beauv.），屬禾本科，又稱稷或粟，最早起源于我國，在我國有8 000 多年的種植歷史。由于其具有耐旱、耐瘠、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等生物學(xué)特性，在我國北方的干旱和半干旱地區(qū)廣泛種植[1]。近年來，谷子種植面積不斷增大，各類病害的發(fā)生率也隨之增大，對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響[2]。其中，谷子黑穗病是谷子生產(chǎn)中的一種常見病害，按照發(fā)病特征分為粒黑穗病、腥黑穗病和黑粉病3 種類型，山西產(chǎn)區(qū)內(nèi)谷子粒黑穗病占絕大部分[3]。谷子粒黑穗病由真菌性病原菌——黑粉菌引發(fā)，主要通過種子傳播[4]，傳播的主要途徑為：谷子采收過程中病原菌污染種子，次年播種時隨著種子進(jìn)入谷田并同時萌發(fā)，從而侵入幼苗，在植株體內(nèi)生長蔓延，最終侵入子房，產(chǎn)生孢子，形成黑穗[5]。

在遭遇病原菌時，植物可依靠自身固有的免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)抗性抵御病原菌侵染。植物能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，病原菌可誘導(dǎo)植物細(xì)胞活性氧爆發(fā)，介導(dǎo)苯丙烷合成途徑產(chǎn)生較多的類黃酮、木質(zhì)素、總酚等，使抗氧化酶和病程相關(guān)蛋白（PR）表達(dá)增強(qiáng)、抗病相關(guān)酶（幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶）活性提高，植株獲得系統(tǒng)抗性。有研究表明，谷子感染黑粉菌后，抗病品種體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性都顯著高于感病品種，表明這些酶活性的增強(qiáng)有助于谷子對黑粉菌的防御[6]。不同品種谷子的遺傳基礎(chǔ)不同，對黑穗病的抗性存在一定差異。但目前關(guān)于谷子抗黑穗病的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究在篩選谷子黑穗病高抗品種冀谷20 和敏感品種長農(nóng)35 的基礎(chǔ)上，對植株抗病生理過程中次生代謝途徑及其產(chǎn)物量、抗病酶活性及抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析，以期為谷子抗病機(jī)制的研究和抗性育種提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

連續(xù)3 a 田間試驗(yàn)統(tǒng)計不同谷子品種黑穗病發(fā)病率，參照溫琪汾等[7]關(guān)于谷子黑穗病抗性水平分級標(biāo)準(zhǔn)，選出對黑粉菌抗性水平差異較大的2 個品種（表1）[8]作為室內(nèi)試驗(yàn)供試品種。供試黑粉菌菌種為2017 年采集于試驗(yàn)田中發(fā)病植株的黑穗病菌冬孢子，經(jīng)揉搓、過篩得到[8]。

表1 供試谷子品種的發(fā)病率及抗性水平

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)對照組谷種（CK-J20、CK-C35）未拌菌，拌菌組谷種（I-J20、I-C35）人工拌黑粉菌，對照組與拌菌組同期播種于育苗盆中，于室內(nèi)（25±2.0）℃培養(yǎng)，相對濕度47%～63%，光照強(qiáng)度≥3 000 lx，光照/黑暗周期為16 h/8 h。待谷子生長至五葉期，取植株地上部分檢測苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性，以及總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 酶活性檢測 取拌菌組與對照組植株地上部分用于酶活測定。PAL 活性參考ROMERO 等[9]的方法進(jìn)行測定；PPO 活性采用鄰苯二酚比色法進(jìn)行測定；幾丁質(zhì)酶活性參考BOLLER 等[10]的方法進(jìn)行測定；β-1，3-葡聚糖酶活性參考JIANG 等[11]的方法進(jìn)行測定。

1.3.2 次生代謝產(chǎn)物含量測定 采用Folin 酚法測定總酚含量，總酚的量用每克樣品含有的焦性沒食子酸毫克數(shù)（mg/g）表示。采用NaNO2-AlCl3-NaOH比色法測定類黃酮含量，其含量用每克樣品中的蘆丁毫克數(shù)表示。參照CHEN 等[12]的方法提取和測定木質(zhì)素的含量，木質(zhì)素的量用每克樣品在280 nm處的吸光度表示。

1.3.3 基因表達(dá)水平檢測 通過RT-PCR 檢測抗性相關(guān)基因（4CL、CCR、CHIB 和WRKY22）與受體蛋白FLS2 的表達(dá)水平。以J20 為試驗(yàn)材料，采用Trizol 法提取總RNA；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將2 μg 總RNA 用Oligo（dT18）引物和反轉(zhuǎn)錄酶混合物轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA 為模板，谷子Actin 基因作為內(nèi)參，使用表2 中的基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表2 RT-PCR 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)取每組3 次重復(fù)的平均值作為該組的檢測值，使用IBM SPSS 24.0 軟件進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，并采用Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑粉菌對谷子幼苗次生代謝的影響

采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，分析高抗品種J20 和高感品種C35 的抗病生理過程，發(fā)現(xiàn)谷種拌菌后2 個品種谷子植株地上部分PAL 活性均顯著提高，但是抗病品種J20 的PAL 活性水平顯著高于C35（圖1）。拌菌組與對照組相比，不同抗性品種的酚類物質(zhì)含量變化趨勢不同，其中，I-J20 的酚類物質(zhì)含量較CK-J20 顯著升高，而I-C35 總酚含量下降，類黃酮含量保持不變；I-J20 的總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量均顯著高于I-C35（圖2）。結(jié)果顯示，谷子在受到黑粉菌侵染后，品種抗性越強(qiáng)，PAL 酶活性增幅越大，酚類物質(zhì)含量積累越多，由此表明，谷子對黑粉菌的抗性與植株次生代謝途徑激活和產(chǎn)物量積累有關(guān)。

2.2 黑粉菌對谷子幼苗PPO 活性的影響

多酚氧化酶活性檢測結(jié)果顯示，谷種拌菌組2 個品種的酶活均顯著高于對照組，且I-J20 酶活性比I-C35 整體偏高（圖3），表明谷子幼苗PPO 活性的增加與品種的抗病性和黑粉菌的誘導(dǎo)都有關(guān)，谷子PPO 活性增加有利于增強(qiáng)谷子幼苗對黑粉菌的抵抗作用。

2.3 黑粉菌對谷子幼苗抗病相關(guān)酶活性的影響

2 個不同抗性品種的谷子，在谷種拌菌后幾丁質(zhì)酶活性均顯著升高，但不同品種間酶活性無顯著差異；谷種拌菌組β-1，3-葡聚糖酶活性與未拌菌對照組間無顯著性差異，但I(xiàn)-J20 的β-1，3-葡聚糖酶活性顯著高于I-C35（圖4）。結(jié)果表明，谷子幼苗幾丁質(zhì)酶活性與品種的不同抗性沒有直接對應(yīng)關(guān)系，C35 的β-1，3-葡聚糖酶對黑粉菌不敏感，可能與植株對病菌的敏感性有一定關(guān)系。

2.4 黑粉菌對谷子幼苗抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

基因轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明，拌菌組中谷子的4 個抗性相關(guān)基因（4CL、CCR、WRKY22 和CHIB）和受體蛋白FLS2 都不同程度地轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖5），其中，CHIB 和4CL 分別上調(diào)188%和120%，F(xiàn)LS2、CCR和WRKY22 的上調(diào)幅度分別為97%，89%和25%。結(jié)果表明，以上基因及受體蛋白在谷子抗黑穗病的生理過程中發(fā)揮了重要作用。

3 討論

病原菌侵入植物后，受病原菌影響，植物體內(nèi)多種酶類、氧化還原物質(zhì)和抗病相關(guān)基因等都發(fā)生了相應(yīng)的變化，在生理、生化和分子水平啟動對應(yīng)的防御應(yīng)答使植株獲得系統(tǒng)抗性，抗性強(qiáng)弱直接決定了植物是否發(fā)病以及發(fā)病程度[13]。本研究表明，谷種拌黑粉菌后，植株出現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)錄、抗病相關(guān)酶活性、次生代謝途徑及產(chǎn)物量的改變，說明谷子對黑粉菌的響應(yīng)是一個涉及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞代謝過程改變的系統(tǒng)性生物學(xué)過程。

本研究表明，拌菌后2 個品種比較，抗病品種J20 的PAL 活性、PPO 活性以及總酚、類黃酮、木質(zhì)素含量均增加，而感病品種C35 酚類物質(zhì)增量不大或保持不變，總酚含量甚至呈下降趨勢。苯丙烷代謝途徑是植物次生代謝產(chǎn)物合成的主要途徑，其中，酚類物質(zhì)是一類重要的次生代謝產(chǎn)物，在植物抗病過程中同時兼有抗氧化性和抗病性[14]。在病原菌—植物互作過程中，次生代謝產(chǎn)物可作為保護(hù)屏障防御病原物侵染，其中有些物質(zhì)還可作為信號分子參與植物的抗病防御反應(yīng)[15]。由此推測，感病品種C35 總酚含量下降與其對黑粉菌的抗性較弱有著直接關(guān)系，即酚類物質(zhì)的大量合成有助于增強(qiáng)谷子對黑粉菌的抗性。參與酚類物質(zhì)代謝過程的PAL和PPO 在植物抗病生理中具有重要作用，其中，PAL 通過次生代謝途徑參與調(diào)控植物抗病性化合物的生物合成過程[16]；PPO 能夠?qū)⒅参矬w內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成對病原菌有毒性作用的醌類物質(zhì)，從而直接抑制病原菌在植物內(nèi)的生長與擴(kuò)散[17]。本研究所檢不同抗性谷子品種間PAL 和PPO 活性的顯著差異可能與其對病原菌的敏感性不同有關(guān)。前人在糜子、玉米和甘蔗[18-20]等的研究中也發(fā)現(xiàn)，這些作物在受到外界病原真菌侵染后，作物體內(nèi)PAL、PPO和POD 等活性上升，且與品種抗性存在正相關(guān)性，證明了與本研究類似的結(jié)論。

抗病相關(guān)酶β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶可通過分解病原菌細(xì)胞壁、誘導(dǎo)抗病相關(guān)酶促反應(yīng)，促使抗病物質(zhì)的累積，增強(qiáng)植物抗病能力。本研究中，幾丁質(zhì)酶活性在拌菌組和對照組間顯著不同，但是在2 個品種間無顯著差異，沒有體現(xiàn)出與谷子品種抗病能力的對應(yīng)關(guān)系；β-1，3-葡聚糖酶活性在敏感品種C35 拌菌組中無明顯響應(yīng)，不利于植物的抗病防御。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道的β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與作物品種抗病性呈正相關(guān)[18]不一致，可能與谷子品種、發(fā)育階段以及環(huán)境因素影響有關(guān)。

基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)答是植物適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)。本研究檢測了2 個谷子抗病生理相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，證實(shí)這些基因在拌菌組上調(diào)表達(dá)。研究顯示，將幾丁質(zhì)酶基因CHIB 導(dǎo)入一些作物中，可使轉(zhuǎn)基因作物株系抗病性顯著增強(qiáng)；基因4CL 編碼4－香豆素輔酶A 連接酶，是木質(zhì)素合成途徑的限速酶；基因CCR 是肉桂酰coA 還原酶（一種木質(zhì)素合成酶），該酶通過調(diào)控木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物的合成參與植物抗病。本研究中，谷子拌菌組中上述基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，與本研究檢測的相應(yīng)酶活性提高、次生代謝產(chǎn)物量增加相一致，是植物獲得抗性的生物學(xué)基礎(chǔ)。FLS2 是一類植物模式識別受體，其通過感知和識別病原菌鞭毛蛋白并啟動免疫信號傳導(dǎo)，隨即觸發(fā)植物先天免疫反應(yīng)，在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄因子WRKY22 能夠?qū)Χ喾N非生物脅迫和稻瘟病菌快速響應(yīng)[21]。本研究中高抗品種J20 拌菌組與對照組間相關(guān)基因的差異轉(zhuǎn)錄，提示植株受體蛋白FLS2 對病原菌進(jìn)行識別，轉(zhuǎn)錄因子WRKY22由此激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)抗病相關(guān)基因（CHIB、4CL 和CCR）的表達(dá)，以增強(qiáng)植株對病原物的防御應(yīng)答。

綜上所述，谷子對黑粉菌的抗性與品種的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)，植株基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)答、細(xì)胞生理代謝改變提供了抗病生理的物質(zhì)基礎(chǔ)，抗病相關(guān)酶、次生代謝途徑及其產(chǎn)物在谷子誘導(dǎo)抗性中發(fā)揮了積極作用。