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        黑猩猩腸道菌群高通量測序分析

        2019-10-25 09:54:02
        浙江畜牧獸醫(yī) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:黑猩猩菌門菌群

        (杭州動(dòng)物園,浙江 杭州 310008)

        隨著社會的進(jìn)步與發(fā)展,動(dòng)物園的職能發(fā)生了轉(zhuǎn)變,動(dòng)物種群管理與建設(shè)變得日益重要,杭州動(dòng)物園內(nèi)現(xiàn)有7只成年黑猩猩(Pantroglodytes),保護(hù)和壯大現(xiàn)有黑猩猩種群已成為工作的重點(diǎn)。黑猩猩與人同屬人科,是現(xiàn)存與人類親緣關(guān)系最近的動(dòng)物,堿基對序列排列上98.77%部分完全相同。

        腸道菌群是生存在機(jī)體腸道內(nèi)的微生物群,種類多,數(shù)量大,與機(jī)體的食物消化、營養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫應(yīng)答等生理活動(dòng)密切相關(guān)[1]。國內(nèi)腸道菌群研究主要對象為家禽家畜,也有部分為珍稀動(dòng)物,包括川金絲猴、大熊貓以及虎等[2-6],尚未有對黑猩猩腸道菌群的多樣性分析。本試驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)對黑猩猩腸道菌群的多樣性進(jìn)行分析,希望能在維持腸道菌群平衡、保證動(dòng)物健康方面提供參考。

        1 材料與方法

        1.1試驗(yàn)動(dòng)物 杭州動(dòng)物園飼養(yǎng)的7只成年黑猩猩,編號1-7:1號20歲雌性,2號12歲雌性,3號10歲雄性,4號9歲雄性,5號9歲雌性,6號8歲雄性,7號8歲雌性。采樣前后食物譜、飼養(yǎng)條件一致,各黑猩猩身體健康。

        1.2樣品處理、數(shù)據(jù)分析 糞樣采集前一天晚上7只黑猩猩單籠飼養(yǎng),于早上8點(diǎn)取樣,挑取少量新鮮糞便于已消毒的采樣管中,7個(gè)糞樣立即于-40 ℃冰箱保存。委托上海派森諾生物科技股份有限公司對樣品進(jìn)行前處理、Illumina Miseq高通量測序及數(shù)據(jù)分析,測序片段為16S rDNA V3~V4可變區(qū)。主要利用FLASH軟件(v1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/),QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology,v1.8.0,http://qiime.org/)對測序序列進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1有效序列與不同分類地位OTU數(shù) 表1中7個(gè)樣品測序獲得有效序列40622-55923條,從門到種的OTU(操作分類單元)數(shù)為1473-2145,1412-2082,1406-2076,1080-1768,425-1079,175-548,各樣品間波動(dòng)較大,個(gè)體間差異明顯。7號樣品有效序列和各分類地位OTU均最少,門、綱、目、科水平OTU最高為5號樣品,有效序列最多為1號樣品,屬、種水平OTU最多的為1號樣品,有效序列量也最多。有效序列與各水平OTU有一定關(guān)聯(lián)性。

        表1 有效序列與不同分類地位OTU數(shù)

        2.2菌群微生物多樣性分析 從圖1可以看出,稀釋曲線隨著測序深度增加逐漸上升,并趨于平緩,說明測序結(jié)果能夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性。Shannon和Simpson為多樣性指數(shù),Shannon和Simpson值越大,說明群落多樣性越高[7-9]。Chao1和ACE為豐富度估計(jì)指數(shù),指數(shù)越大,表明群落的豐富度越高[10-11]。各樣本的多樣性指數(shù)見表2,Shannon值在7.09-8.52之間,Simpson值在0.938380-0.987122之間,Chao1值在1475.00-2658.01之間,ACE值在1475.35-2682.28之間。7號樣品Simpson,Chao1和ACE值均為最小,分別為0.938380,1475.00和1475.35,Shannon值最小的為6號樣品,5號樣品的各指數(shù)值均最高,表明5號樣品的腸道菌群豐富度和多樣性最高,與有效序列和各水平OTU結(jié)果一致。

        注:橫坐標(biāo)為樣本抽取的有效序列數(shù),縱坐標(biāo)為OTU數(shù)目。圖1 稀釋曲線

        樣品SimpsonChao1ACEShannon10.9579042248.222456.297.4020.9601082220.302386.697.2830.9690271753.001753.007.8740.9800091666.001667.117.9050.9871222658.012682.288.5260.9432662147.362217.667.0970.9383801475.001475.357.21

        2.3門屬分類水平微生物組成分析

        2.3.1門水平的微生物類群 所有樣品共含有14個(gè)菌門,平均含量前五的菌門為擬桿菌門(39.5%),厚壁菌門(36.7%),變形菌門(0.6%),WPS-2(7.4%),螺旋體(3.5%),除2號和5號樣品的最優(yōu)勢菌群為厚壁菌門,其余個(gè)體均為擬桿菌門。2號和5號樣品沒有纖維桿菌門,僅3號,5號和6號樣品沒有互養(yǎng)菌門, 7號樣品僅有TM7, 4號和6號樣品僅有迷蹤菌門,除這四種菌門外其它均為共有,含量各異。

        圖2 門水平的微生物類群組成

        2.3.2屬水平的微生物類群 7個(gè)樣品中平均含量前七的菌屬為普氏菌屬(24.6%),未分類瘤胃菌屬(12.6%),琥珀酸弧菌屬(8.6%),未分類WPS-2(7.4%),未分類擬桿菌屬(4.9%),未分類梭菌屬(4.9%),未分類BS11(4.3%),未分類的菌屬占比很大。2號樣品的最優(yōu)勢菌屬為未分類擬桿菌屬(18.4%),7號樣品的最優(yōu)勢菌屬為未分類 BS11 (29.9%),其它樣品的最優(yōu)勢菌屬均為普氏菌屬(23.6-34.3%)。

        注:僅標(biāo)注平均含量前七屬,共有102個(gè)屬較多不好標(biāo)注。圖3 屬水平的微生物類群組成

        2.4基于UniFrac距離的樣本聚類分析 各樣品的聚類分析見圖4,樣品間的分枝長度越短,兩樣本越相似,3和6號樣品相似度最高,其次為4和5號,2和7號,但3和6號,2和7號的多樣性指數(shù)相差較大,4和5號序列量、OTU數(shù)相差較大。

        圖4 基于Unweighted UniFrac距離矩陣的UPGMA聚類分析圖

        3 討論

        7個(gè)樣品測序獲得有效序列40622-55923條,從門到種的OTU數(shù)為1473-2145,1412-2082,1406-2076,1080-1768,425-1079,175-548,多樣性指數(shù)Shannon值在7.09-8.52之間,Simpson值在0.938380-0.987122之間,Chao1值在1475.00-2658.01之間,ACE值在1475.35-2682.28之間,各樣品間波動(dòng)較大,個(gè)體間差異明顯。樣品共含有14個(gè)菌門,11個(gè)菌門為共有,3個(gè)非共有菌門在各樣品中的含量各異,除2號和5號樣品的最優(yōu)勢菌門為厚壁菌門,其余個(gè)體均為擬桿菌門,2號和7號樣品的最優(yōu)勢菌屬分別為未分類擬桿菌屬、未分類 BS11,其它樣品的最優(yōu)勢菌屬均為普氏菌屬。聚類分析也體現(xiàn)出腸道菌群相似性中有差異性,引起差異性的原因可能是個(gè)體特異性,性別和年齡[12],其差異性也體現(xiàn)了腸道菌群的復(fù)雜性。

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