林青華，屈文佳，賈哲，徐新房，劉夢(mèng)楠，賈天穎，周改蓮，李向日,4*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102488)

斑馬魚(yú)是輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚(yú)屬的一種硬骨魚(yú)，其基因與人類基因相似度達(dá)87%，而且對(duì)藥物的反應(yīng)也與人相似[1]。斑馬魚(yú)具有體外受精、發(fā)育,胚胎透明,試驗(yàn)周期短,樣本量大等傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為一種在生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用模式生物[2]，并在急性毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、血管研究和癌癥研究方面顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[3-7]。

1 材料

1.1 藥材

生檳榔購(gòu)于北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.成熟種子的炮制品，樣品留樣存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院炮制教研室。

1.2 動(dòng)物

AB型斑馬魚(yú)幼魚(yú)(受精卵正常發(fā)育4天)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，斑馬魚(yú)親本購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

1.3 儀器與試劑

斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生科技公司)，LRH-250 Z型恒溫生化培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)，島津LC-20 A高效液相色譜儀(LC-20 AD泵，SPD-20 A檢測(cè)器，Lcsolution處理軟件，島津公司)，Ultimater?XB-SCX色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技)，紫外-可見(jiàn)分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)，F(xiàn)A-1004電子分析天平(上海天平儀器廠)，SB 25-12 DTDN型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

沒(méi)食子酸對(duì)照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20121107，純度99.0%)，檳榔堿氫溴酸鹽(批號(hào)1391，純度>98.0%)購(gòu)于上海施丹德生物技術(shù)有限公司，去甲基檳榔堿氫溴酸鹽(批號(hào)Q-075-170930，純度>98.0%)、檳榔次堿鹽酸鹽(批號(hào)B-084-170928，純度>98.0%)購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，去甲基檳榔次堿鹽酸鹽(批號(hào)JS20171103，純度>98.0%)購(gòu)于湖北巨勝科技有限公司；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鈣、鹽酸、溴水、磷酸、氨水、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮(北京化工廠)，碳酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰(天津福晨化學(xué)試劑廠)，鉬酸鈉、明膠(天津市化學(xué)試劑廠)，干酪素(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖與繁育

2.1.1 斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液的配制

按照Z(yǔ)ebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)，分別適量稱取NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，最終配成每升含0.14 mol NaCl、5.4 mol KCl、0.25 mol Na2HPO4、0.44 mol K2HPO4、1.3 mol CaCl2、1.0 mol MgSO4和4.2 mol NaHCO3水溶液，即得斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液。

2.1.2 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖及繁育

斑馬魚(yú)在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)，其水溫為(28±0.5)℃，pH值7.0～7.2，電導(dǎo)率為450～550 μs/cm，每天黑暗環(huán)境(10 h)與光照環(huán)境(14 h)交替進(jìn)行，以豐年蝦幼蟲(chóng)喂食成年斑馬魚(yú)，每日3次。

暗周期開(kāi)始前，將選取的雄性與雌性成年斑馬魚(yú)按照2∶1的比例放入產(chǎn)卵缸中，用隔板將其分開(kāi)；暗周期結(jié)束后抽去隔板，雄魚(yú)與雌魚(yú)在光照刺激下完成交配，4 h后收集合格受精卵，將其用胚胎培養(yǎng)液清洗干凈后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置生化培養(yǎng)箱中孵育；每日上午更換胚胎培養(yǎng)液并及時(shí)除去死亡胚胎及胎衣，4 d后選取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行急性毒性研究。

2.2 試藥制備

2.2.1 總生物堿的制備

稱取生檳榔粉末(過(guò)80目篩)500 g，加10倍量去離子水，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮至小體積，放冷；石油醚萃取3次，水層再用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，減壓回收溶劑，得二氯甲烷部位；二氯甲烷部位用去離子水復(fù)溶，濾除不容物，減壓除去溶劑，得總生物堿部位(棕黃色的油狀物)，備用。

2.2.2 總鞣質(zhì)的制備

取生檳榔粉末100 g，加10倍量的80%丙酮超聲提取2 h，濾除藥渣，回收溶劑，得鞣質(zhì)粗提物；將其用去離子水復(fù)溶并稀釋至1 000 mL，靜置，濾除沉淀，得鞣質(zhì)粗提物水溶液；取明膠適量，制成1%的明膠水溶液，將其緩緩加入鞣質(zhì)粗提物水溶液中，邊加邊攪，靜置，離心(4 000 r/min，4 min)，沉淀另存，上清液再加明膠水溶液，反復(fù)數(shù)次直至無(wú)沉淀產(chǎn)生為止；合并沉淀物，乙酸乙酯復(fù)溶，少量多次，直至乙酸乙酯不呈明顯紅棕色為止，合并乙酸乙酯液，45℃減壓回收溶劑，得總鞣質(zhì)部位，備用。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 總生物堿的含量測(cè)定

按照本課題組確定的HPLC方法對(duì)總生物堿部位的含量進(jìn)行測(cè)定，具體方法如下：色譜柱為Ultimate XB-SCX(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽溶液(2 mL磷酸，2 mL氨水→1 000 mL)(72∶28)；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速為1 mL/min。

檢測(cè)結(jié)果表明所得生物堿部位中總生物堿的含量為6.67 mg/mL，其中含檳榔堿3.33 mg/mL、去甲基檳榔堿2.43 mg/mL、檳榔次堿0.23 mg/mL和去甲基檳榔次堿0.67 mg/mL。對(duì)照品及供試品色譜圖具體見(jiàn)圖1。

2.3.2 總鞣質(zhì)的含量測(cè)定

鞣質(zhì)部位的含量測(cè)定方法參照2015版《中國(guó)藥典》(四部)中“2202鞣質(zhì)含量測(cè)定法”項(xiàng)下內(nèi)容進(jìn)行含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明所得鞣質(zhì)部位中總鞣質(zhì)含量為53.74%。

2.4 急性毒性研究

2.4.1 總生物堿部位的急性毒性研究

精密移取總生物堿部位1.8 mL，加至38.2 mL胚胎培養(yǎng)液中，搖勻，得供試品母液，備用；選取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)置12孔板中，每孔20條，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日吸棄各孔培養(yǎng)液，加入4 mL用母液稀釋成不同濃度的供試品溶液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，次日統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)死亡情況并計(jì)算LC50，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

注:色譜峰1：檳榔堿，色譜峰2：檳榔次堿，色譜峰3：去甲基檳榔次堿，色譜峰4：去甲基檳榔堿圖1 對(duì)照品(A)和供試品(B)中4種生物堿在215 nm波長(zhǎng)下的高效液相色譜圖

表1 生檳榔中總生物堿部位對(duì)斑馬魚(yú)的LC50(μg/mL)

注：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的機(jī)率單位加權(quán)回歸法(Bliss法) 計(jì)算LC50

2.4.2 總鞣質(zhì)部位的急性毒性研究

精密稱取鞣質(zhì)部位0.099 9 g，加50 mL胚胎培養(yǎng)液，超聲溶解，取其2.5 mL，加47.5 mL胚胎培養(yǎng)液，稀釋，搖勻，得供試品母液，備用；選取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)置12孔板中，每孔20條，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日吸棄各孔培養(yǎng)液，加入4 mL用母液稀釋成不同濃度的供試品溶液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，次日統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)死亡情況并計(jì)算LC50，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 生檳榔中總鞣質(zhì)部位對(duì)斑馬魚(yú)的LC50(μg/mL)

注：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的機(jī)率單位加權(quán)回歸法(Bliss法) 計(jì)算LC50

3 討論

檳榔中的生物堿屬于哌啶類生物堿，是小分子液體化合物，遇熱不穩(wěn)定且易揮發(fā)，制備難度相對(duì)較大。本課題組在制備生物堿部位的過(guò)程中，通過(guò)比較常規(guī)萃取法(生檳榔水提物混懸液依次用石油醚、二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷層，即得)、大孔樹(shù)脂富集法(生檳榔水提液過(guò)大孔樹(shù)脂，收集流出液，回收溶劑，即得)、二氯甲烷滲漉法(石油醚脫脂后的生檳榔粉末，用二氯甲烷滲漉提取，回收溶劑，即得)和“反萃法”(具體見(jiàn)2.2.1 生物堿部位的制備)，發(fā)現(xiàn)“反萃法”所得總生物堿含量(以檳榔堿、去甲基檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔次堿的總量計(jì))高且不含鞣質(zhì)類成分，故采用該法制備生檳榔中的總生物堿。

鞣質(zhì)是檳榔澀味的主要成分，含量約占15%左右，但其易氧化并具有熱不穩(wěn)定性和光敏性的特點(diǎn)[13]，因此制備鞣質(zhì)部位也存在一定難度。本課題組在制備鞣質(zhì)部位的過(guò)程中，通過(guò)比較明膠沉淀法和大孔樹(shù)脂富集法[14-15]，發(fā)現(xiàn)明膠沉淀法操作簡(jiǎn)單，總鞣質(zhì)含量高且不含生物堿類成分，故采用明膠沉淀法制備生檳榔中的總鞣質(zhì)。鑒于丙酮可以與水以任意比例混溶，而乙酸乙酯水溶性(8.3 g/100 mL，20℃)低且極性與丙酮相近，因此采用乙酸乙酯為溶劑提取明膠沉淀中的鞣質(zhì)，以便利于溶劑回收，縮短鞣質(zhì)受熱時(shí)間。

斑馬魚(yú)急性毒性研究結(jié)果表明，生檳榔中總生物堿、總鞣質(zhì)部位的LC50值分別為136.14 μg/mL(表1)和21.52 μg/mL(表2)，提示生檳榔中總鞣質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性大于總生物堿，說(shuō)明鞣質(zhì)類成分也是生檳榔的毒性成分。由于生檳榔中鞣質(zhì)含量較高，因此有必要對(duì)其毒性情況進(jìn)行深入研究 。