稅磊，余文興

(遂寧市中心醫(yī)院，四川遂寧629000)

鼻咽癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤。環(huán)境的不斷惡化、不良生活習(xí)慣的影響均使得鼻咽癌的發(fā)病率正逐年上升［1，2]，放射治療(以下簡稱放療)是目前臨床鼻咽癌的首選治療方法［2]，疾病進(jìn)展早期的療效較為顯著，可較好的抑制腫瘤生長，但當(dāng)疾病進(jìn)展至后期時(shí)約40%的患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等不良事件［3]。同時(shí)放療是一種傷害性治療方法，長期放療可產(chǎn)生一系列不良并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，尋找一種療效顯著、穩(wěn)定、不良作用輕的化療藥物是目前臨床鼻咽癌治療的研究熱點(diǎn)。抑制腫瘤血管生成相關(guān)研究是目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)課題之一，內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的一個(gè)重要因子。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是腫瘤細(xì)胞增殖過程中一個(gè)重要核抗原，可間接反應(yīng)細(xì)胞增殖的活躍。白蘞素是一種黃酮類化合物，又稱二氫楊梅素(DMY)，具有鎮(zhèn)痛、祛痰、止咳、消炎等療效［4]。最新研究［5～7]結(jié)果顯示，在抗腫瘤方面白蘞素也具有不錯(cuò)的效果，可明顯抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤多藥耐藥的發(fā)生。目前未見有關(guān)白蘞素對鼻咽癌的治療作用及其相關(guān)機(jī)制報(bào)告。2019年2～4月，我們構(gòu)建鼻咽癌小鼠模型，觀察白蘞素灌胃治療及聯(lián)合放療的鼻咽癌模型小鼠腫瘤生長情況，并探討白蘞素的可能作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物及儀器 50只體質(zhì)量(19±1)g的雄性清潔級BALB/c(nu/nu)裸小鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008－0016，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。鼻咽癌CNE－2細(xì)胞系購自上海細(xì)胞生物所。白蘞素，批號17031501，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng);鼠PCNA抗體及鼠VEGF抗體均購自Sant Cruz公司;RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自GIBICO公司。

1.2 鼻咽癌小鼠模型構(gòu)建 取CNE－2細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，取生長期細(xì)胞懸浮液0.2 mL接種于50只小鼠體內(nèi)，制備鼻咽癌小鼠模型，造模7 d左右小鼠開始出現(xiàn)腫瘤，出現(xiàn)的時(shí)間和腫瘤直徑略有差別，最晚于接種后第10天出現(xiàn)，起初均為接種部位出現(xiàn)可觸及的綠豆大小的瘤塊，并隨著時(shí)的延長而逐漸增大，每7天測量一次腫瘤直徑。接種21 d時(shí)有48只鼠腫瘤直徑在(200±100)mm3之間，兩只腫瘤直徑＜100 mm3的鼠予以剔除，最終納入48只小鼠。

1.3 鼻咽癌模型小鼠分組及白蘞素給予方法 48只小鼠均分為四組，分別為模型對照組、白蘞素組、放療組、白蘞素+放療組，每組12只。模型對照組每天生理鹽水灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g;白蘞素組每天50 mg/kg白蘞素灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g;白蘞素+放療組每天50 mg/kg的白蘞素灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g，進(jìn)行腫瘤局部單次8 Gy照射;放療組每天灌胃生理鹽水，灌胃體積0.1 mL/10 g，然后給予腫瘤局部單次8 Gy照射，各組均干預(yù)21 d。

白蘞素+放療組白蘞素+放療組1.4各組腫瘤體積、抑瘤率測算 干預(yù)1、7、14、21、28 d 時(shí)測量腫瘤體積，共測量5次，測量方法如下：用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測出腫瘤的長直徑(a)與短直徑(b)，測算腫瘤體積，腫瘤體積=(ab－a2)/6，干預(yù)28 d測量腫瘤體積后處死動(dòng)物，小心剝離腫瘤組織，將腫瘤組織立即浸入足量的10%多聚甲醛溶液中固定，計(jì)算各組的抑瘤率(%)，抑瘤率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤體積/模型對照組平均腫瘤體積)×100%。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組腫瘤組織VEGF、PCNA檢測 采用免疫組化法。取各組腫瘤組織，10%多聚甲醛中固定24 h，小心切取大小適中的組織于包埋盒中，蒸餾水沖洗后經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各組腫瘤組織VEGF、PCNA。結(jié)果判定：VEGF表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性細(xì)胞光鏡下細(xì)胞質(zhì)中有大量棕黃色顆粒，VEGF表達(dá)量越多，顏色越深，棕黃色顆粒就越多，每組均于10×40倍鏡下隨機(jī)拍攝20張圖片輸入IPP彩色病理圖文分析系統(tǒng)計(jì)算光密度值進(jìn)行量化分析，最后取平均光密度值進(jìn)行比較分析，平均光密度值=光密度值之和/面積之和，平均光密度值越大，說明VEGF表達(dá)量越高;PCNA表達(dá)于細(xì)胞核中，陽性細(xì)胞可見細(xì)胞核被染成棕黃色，每組均于10×40倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)清晰視野中的細(xì)胞500個(gè)，同時(shí)記錄棕黃色細(xì)胞數(shù)，用棕黃色細(xì)胞數(shù)/500再乘以100%即為PCNA增殖指數(shù)，最后取PCNA增殖指數(shù)進(jìn)行比較分析，PCNA增殖指數(shù)越高，說明腫瘤細(xì)胞增殖越活躍。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD法，若資料不滿足方差分析條件則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腫瘤體積及抑瘤率比較 干預(yù)第1、7、14、21、28天時(shí)各組小鼠腫瘤體積比較見表1。白蘞素+放療組白蘞素+放療組白蘞素+放療組干預(yù)28 d時(shí)，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組抑瘤率分別為 34.27% ±5.13%、27.93% ±4.75%、48.60% ±6.20%，與放療組、白蘞素組比較，白蘞素+放療組抑瘤率高(P均＜0.05)。

表 1 干預(yù) 1、7、14、21、28 d 時(shí)各組小鼠腫瘤體積比較(mm3，±s)

表 1 干預(yù) 1、7、14、21、28 d 時(shí)各組小鼠腫瘤體積比較(mm3，±s)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05;與白蘞素組比較，#P＜0.05;與放療組比較，※P＜0.05。

組別28 d白蘞素組 122.82 ±68.29 206.04 ± 79.00 194.23 ±122.87* 187.37 ±25.94* 168.78 ±22.95腫瘤直徑干預(yù)1 d 干預(yù)7 d 干預(yù)14 d 干預(yù)21 d 干預(yù)＊※白蘞素 +放療組 121.00 ±77.04 204.23 ±112.87 170.37 ±101.94* 141.78 ±54.95* 120.37 ±47.87*#※放療組 121.94 ±41.62 202.16 ± 84.67 176.84 ± 68.75 156.48 ±20.73 153.93 ±24.03*模型對照組 122.70 ±37.15 222.86 ± 60.29 231.87 ± 64.81 255.26 ±19.49 234.19 ±11.12

2.2 各組腫瘤組織VEGF表達(dá)量比較 模型對照組、放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織VEGF 表達(dá)量分別為0.041 ±0.004、0.017 ±0.004、0.015 ±0.002 和 0.003 ±0.002，與模型對照組比較，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織VEGF表達(dá)量降低(P均＜0.05)，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織VEGF表達(dá)量兩兩比較，P 均 ＜0.05。

2.3 各組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)比較 模型對照組、放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)分別為31.02% ±2.45%、17.04%±2.55%、10.36% ±3.15% 和 9.15% ±1.72%，與模型對照組比較，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)降低(P均＜0.05)，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)兩兩比較，P均＜0.05。

3 討論

近年鼻咽癌的發(fā)病率越來越高，已成為臨床上常見的惡性腫瘤之一。目前臨床上治療鼻咽癌的主要措施為放射治療，這與鼻咽癌特殊的生物學(xué)行為、病理類型以及解剖學(xué)結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)，但是放射治療僅對早期患者效果明顯，并且5年生存率仍然低于60%，對于晚期患者進(jìn)行放射治療，5年生存率更低，因?yàn)橥砥诨颊咴谥委熯^后很容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥，最終導(dǎo)致治療失?。?.9]，因此降低鼻咽癌患者的復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是目前急需解決的問題之一。在進(jìn)行放射治療的時(shí)候不僅可以殺死癌細(xì)胞，也可以殺死人體正常的組織細(xì)胞，特別是對于造血系統(tǒng)損害較大，因此在進(jìn)行放射治療后，患者會(huì)出現(xiàn)一系列并發(fā)癥。目前認(rèn)為鼻咽癌的發(fā)生與多個(gè)因素有關(guān)，包括環(huán)境因素、遺傳因素、個(gè)人生活習(xí)慣及EB病毒感染，這些因素都會(huì)不同程度導(dǎo)致鼻黏膜纖毛輸送功能受損，最終引發(fā)鼻咽癌。白蘞素主要活性成分為黃酮類化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎等多種奇特功效，因此本次研究將其用于聯(lián)合治療鼻咽癌，觀察其抗腫瘤活性。

眾所周知，腫瘤細(xì)胞的生長繁殖有賴于新生毛細(xì)血管的生成，抑制腫瘤血管生成相關(guān)的研究是目前研究的熱點(diǎn)課題之一，白蘞素對血管生成具有一定的抑制作用，它是否可以通過這一重要機(jī)制來抑制腫瘤細(xì)胞的生長目前還不得而知，也未見相關(guān)報(bào)道。本研究首先探討了白蘞素與鼻咽癌細(xì)胞生長的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的生長，連續(xù)灌胃給藥21天進(jìn)行干預(yù)后，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用與放射治療無明顯差異，并且與放射治療聯(lián)合使用時(shí)可取得更好的抑制作用，這間接的說明兩種治療措施抑制腫瘤細(xì)胞生長的途徑不同，同時(shí)使用這兩種療法，可以通過不同的機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞生長，從而提高治療效果，但是對兩種措施進(jìn)行綜合比較后發(fā)現(xiàn)，盡管對腫瘤的抑制作用都較好，但是各有其優(yōu)缺點(diǎn)，放射治療起效快，但是對患者身體的不良反應(yīng)較大，白蘞素盡管還未發(fā)現(xiàn)明顯的不良作用，但是起效慢，需要進(jìn)行連續(xù)21天的大劑量治療，并且治療效果尚需及進(jìn)一步大樣本研究。雖然通過本次研究還不能肯定是否可將它應(yīng)用于臨床取代放射治療來治療鼻咽癌，但是明確了其在抑制鼻咽癌細(xì)胞生長時(shí)的效果，為今后的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的一個(gè)重要因子就是VEGF，它不僅對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化具有明顯的促進(jìn)作用，而且還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，這是因?yàn)樗梢源龠M(jìn)，間質(zhì)膠原酶和金屬蛋白酶的生成，由于它具有這些重要的生物學(xué)活性，因此它的高表達(dá)可以明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤，這也是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制，同時(shí)也是一個(gè)重要的預(yù)測因子［10]。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，白蘞素治療和放療均可明顯明顯減少腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用在聯(lián)合使用時(shí)更強(qiáng)，VEGF的表達(dá)也更低，這說明白蘞素抑制腫瘤細(xì)胞生長的一個(gè)重要機(jī)制就是抑制VEGF的表達(dá)。

PCNA與腫瘤細(xì)胞的DNA合成有緊密的關(guān)系，是腫瘤細(xì)胞增殖過程中一個(gè)重要的核抗原，處于增殖期的細(xì)胞核中均有該抗原的表達(dá)，他表達(dá)量的增高可間接的反應(yīng)出細(xì)胞增殖的活躍。在本次研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，模型對照組中腫瘤細(xì)胞的PCNA表達(dá)量高于其他三組，說明該組的腫瘤細(xì)胞增殖活躍，而其他三組通過施加相應(yīng)的干預(yù)措施后，腫瘤細(xì)胞的生長增殖受到了抑制，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且白蘞素治療和放療差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明二者在治療鼻咽癌的時(shí)候都具有不錯(cuò)的效果，都可以有效抑制腫瘤細(xì)胞新生毛細(xì)血管的生成，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并且這種治療效果在聯(lián)合使用時(shí)更強(qiáng)。盡管這些機(jī)制還不完全清楚，但是有相關(guān)研究［11]認(rèn)為，在進(jìn)行抗腫瘤治療的時(shí)候正確的使用血管生成抑制劑，可改善腫瘤的微環(huán)境，使得異常增生的毛細(xì)血管趨于正常，幫助抗腫瘤藥物順利到達(dá)靶器官，同時(shí)由于腫瘤組織新生毛細(xì)血管的形成受到抑制，這也使得腫瘤組織的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的供應(yīng)受到抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

綜上所述，白蘞素可抑制鼻咽癌小鼠的腫瘤生長，白蘞素灌胃治療及聯(lián)合放療抑制鼻咽癌小鼠腫瘤生長的效果優(yōu)于白蘞素灌胃。白蘞素的可能作用機(jī)制為抑制腫瘤組織PCNA、VEGF的表達(dá)。白蘞素、放療二者可能協(xié)同抑制腫瘤組織PCNA、VEGF的表達(dá)。本次研究僅初步探討了白蘞素抗腫瘤活性及其作用機(jī)制，但是還需進(jìn)行更深入的研究來肯定其療效，同時(shí)也需要檢測更多的指標(biāo)來全面分析其作用機(jī)制。