□ 晏曉清 張艷芳 陳 芩 朱曉玲 章 劍 黃岡大別山檢測認(rèn)證有限公司

黑米的顏色來源于沉積在種皮上的天然色素花青素（黑米色素），黑米色素是黑米營養(yǎng)價(jià)值所在[1-3]。黑米色素易溶于水、乙醇等極性大的溶劑，難溶于油脂等非極性溶劑，因而大多文獻(xiàn)報(bào)道的黑米色素提取溶劑為甲醇、乙醇等極性溶劑。黑米中黑米色素最常見的提取鑒定方法是乙醇溶液萃取、紫外分光光度計(jì)法[4-6]。本實(shí)驗(yàn)意在建立超聲波提取、高效液相色譜法檢測黑米中花青素含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與主要試劑

AS10200T-10L超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；L C-1200液相色譜（安捷倫科技公司）；BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；原花青素（含量≥95%，成都曼思特生物科技有限公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（分析純，30～60 ℃，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法和測定方法

原料（黑米）→研磨過50目篩→黑米粉→加入乙醇（乙醇濃度65%，料液比1∶7，pH值為5.0）→超聲提取（提取時(shí)間10 min；超聲提取溫度55 ℃；超聲波功率300 W）→脫脂（加水10 mL、石油醚20 mL超聲10 min，用一次性吸管除去上層清液，脫去黑米中的脂肪）→乙酸乙酯20 mL超聲10 min→過濾待上機(jī)。

色譜條件：液相色譜帶二極管陣列檢測器，色譜柱為C18色譜柱，檢測波長220 nm。流動(dòng)相：水+甲酸+乙腈（5+75+20）。進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL/min；柱溫30 ℃。

2 黑米色素結(jié)果與分析

2.1 料液比對花青素提取率的影響

稱取5份5.000 g黑米粉于比色管中，分別按料液比1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10加入75%的乙醇，60 ℃、5 min，300 W超聲提取，提取液脫脂、除雜、過濾、上機(jī)。

從圖1可知 ，1∶6～1∶ 7時(shí)隨浸提溶劑增加，花青素濃度增加；1∶7～1∶9時(shí)隨浸提溶劑增加，花青素濃度下降；料液比1∶9～1∶10時(shí)隨浸提溶劑增加，花青素濃度又有所增加。料液比從1∶6到1∶10，花青素的濃度呈波浪型。1∶7時(shí)花青素濃度達(dá)到最大值。故選擇1∶7為最佳料液比。

2.2 乙醇濃度對花青素提取率的影響

稱取5份5.000 g黑米粉于比色管中，按料液比1∶8分別加入濃度為65%、70%、75%、80%、85%的 乙醇，60 ℃、5 min，300 W超聲提取，提取液脫脂、除雜、過濾、上機(jī)。結(jié)果如圖2所示。

圖1 料液比對花青素濃度的影響

圖 2 乙醇濃度對花青素濃度的影響

從圖2可知，隨乙醇濃度的增加，提取液中花青素濃度也逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)65%，出現(xiàn)峰值。故選擇65%乙醇為最佳提取劑。

2.3 超聲提取溫度對花青素提取率的影響

稱取5份5.000 g黑米粉于比色管中，按料液比1∶8加入濃度為75%的乙醇，超聲提取溫度分別設(shè)為45、50、55、60、65 ℃，300 W超聲5 min，提取液脫脂、除雜、過濾、上機(jī)。結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲提取溫度對花青素濃度的影響

從圖3可知，隨著提取溫度的升高，花青素提取率呈先上升后下降的趨勢。故選擇55 ℃為最佳提取溫度。

2.4 超聲提取時(shí)間對花青素提取率的影響

稱取5份5.000 g黑米粉于比色管中，按料液比1∶8加入濃度為75%的乙醇，超聲提取時(shí)間分別設(shè)為3、5、6、8、10、11 min，60 ℃、300 W超聲提取，提取液脫脂、除雜、過濾、上機(jī)。結(jié)果如圖4所示。

從圖4可知，超聲提取時(shí)間延長，提取液中花青素濃度增大。3～6 min，濃度增加明顯；6～11 min時(shí)平緩。10 min達(dá)峰值，故選擇10 min為最佳提取時(shí)間。

圖4 超聲提取時(shí)間對花青素濃度的影響

2.5 黑米色素提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察料液比、乙醇濃度、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間對花青素提取率的影響。進(jìn)行L9(34) 正交試驗(yàn)（見表1），以提取液中花青素的濃度為評價(jià)指標(biāo)，確定黑米中花青素提取的最佳工藝條件。

結(jié)果（表2）表明，影響黑米色素提取濃度的因素順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C，即超聲提取時(shí)間對花青素提取的影響最大，其次為料液比，再次為乙醇濃度，影響最小的是超聲提取溫度。當(dāng)浸提溶劑為乙醇時(shí)，超聲波輔助提取黑米花青素的最優(yōu)組合為：A2B1C2D3，即正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝條件料液比為1∶8，乙醇濃度為65%，超聲溫度為55 ℃，超聲提取時(shí)間為10 min。

表 1 黑米中花青素的提取工藝條件正交實(shí)驗(yàn)表

表 2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以黑米為原料，采用超聲波輔助提取，液相色譜法定量分析。單因素實(shí)驗(yàn)分析了提取過程中超聲波功率、料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度及pH對黑米中花青素提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)獲得了黑米中花青素提取的最佳工藝條件：料液比1∶7，乙醇濃度為65%，超聲提取時(shí)間為10 min，超聲提取溫度為55 ℃，pH值為5.0，超聲波功率為300 W。

根據(jù)市場購買大米檢測結(jié)果，花青素大量存在于黑米中，極少量存在于普通大米中，可作為評判摻假黑米的特征指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)為建立更加準(zhǔn)確成熟的真假黑米檢測方法提供了依據(jù)。