張 貞，呂 所，何光侶

(云南白藥集團(tuán)，云南 昆明 650000)

嬰幼兒護(hù)膚品由于使用人群特殊，故采用一些富含天然成分、具有高保濕配方的清潔、滋潤功能的高度安全產(chǎn)品是必要的選擇，這些成分在保護(hù)嬰幼兒皮膚同時(shí)，也為微生物提供了良好的生長環(huán)境，如果化妝品受到微生物污染會(huì)導(dǎo)致其成分發(fā)生改變，將會(huì)直接損害嬰幼兒皮膚，所以需要構(gòu)建一個(gè)防腐體系[1]。本工作所檢測的7種禁用組分均為抗生素藥物，可用于構(gòu)建防腐體系。氟康唑、克霉唑、 萘替芬、聯(lián)苯芐唑、萘替芬、咪康唑、益康唑和灰黃霉素具有良好的抗菌作用，在臨床上常被用于治療各種因微生物感染引起的病癥[2-8]。由此可見這些抗生素類藥品，能夠起到防腐作用。但長期使用含抗生素的化妝品，會(huì)產(chǎn)生藥物依賴和皮炎等副作用，最終還成人體疫力的減弱[9]。由于抗生素類藥物以上的優(yōu)勢，某些不法廠家很有可能在化妝品中添加此類藥物，這將會(huì)給嬰幼兒生長發(fā)育帶來諸多健康風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)檢驗(yàn)者有義務(wù)對其開展檢驗(yàn)工作。在15年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》已對常見抗生素類藥物的添加做出檢驗(yàn)規(guī)定，故此檢驗(yàn)方法借鑒此手冊[10]。

1 主要儀器與試劑

1.1 儀器

TSQ QUANTIS超高效液相儀(賽默飛)， TSQ QUANTIS三重四極桿質(zhì)譜儀(賽默飛)，超聲儀(FUNGICAB)，電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)，CPA224S分析天平(塞多利斯天平)， ZH-2 BLENDER渦旋震蕩器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器制造廠)。

1.2 試劑

灰黃霉素，益康唑，咪康唑，克霉唑，氟康唑，聯(lián)苯芐唑，萘替芬等標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于97%)(中國食品藥品檢定研究院)，色譜純乙腈(默克股份兩合公司)，硫酸二甲酯(滬試公司)，色譜純乙酸(國家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，三乙胺(安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，氯化鈉(國家化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(上?；睾站S化工)。

飽和氯化鈉溶液：稱取上述氯化鈉40 g，置于250 mL磨口錐形瓶中加入100 mL水超聲15 min即可。

0.3 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取上述氫氧化鈉1.2 g，置于250 mL燒杯中，加入100 mL水，用玻璃棒攪拌至溶解即可。流動(dòng)相的配制：

流動(dòng)相A：0.1%乙酸；

流動(dòng)相B：乙腈(含有0.1%乙酸)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取灰上述黃霉素、克霉唑、益康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、萘替芬各10mg，置于同一10 mL容量瓶中，加上述乙腈稀釋溶解并定容到刻度線，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

2 實(shí)驗(yàn)及結(jié)果討論

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈配制濃度為10，25，500，100，300，500 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.1.2 樣品前處理

精確稱取樣品0.5 g 置于25 mL具塞比色管中，加入已配制好的飽和氯化鈉溶液1 mL，渦旋30 s，加入乙上述腈),20 mL，渦旋30 s，超聲提取30 min，渦旋30 s，加入乙腈定容至刻度，4500 r/min離心5 min，取上層清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，濾液轉(zhuǎn)入液相小瓶作為待測液。

2.1.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備

精確稱取取空白樣品0.5 g，置于25mL具塞比色管中，分別加入已配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，按照以上樣品前處理步驟進(jìn)行前處理，即得到濃度為1、2.5、5、10、30、30、50 μg/g的未衍生化基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，然后吸取部分，轉(zhuǎn)入液相小瓶。

2.1.4 儀器條件

2.1.4.1 色譜條件

色譜柱：C8柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μmm)；

流動(dòng)相的梯度洗脫程序：由于7種化合物的極性差別較大故采用梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相的梯度洗脫程序

流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI源)；

監(jiān)測模式：正離子監(jiān)測模式；

噴霧壓力：40psi；

干燥氣流速：10 L/min；

干燥氣溫度：350℃；

毛細(xì)管電壓：4000 V；

0～1.5 min：不進(jìn)入質(zhì)譜儀分析，1.5～9 min：進(jìn)入質(zhì)譜分析。

2.1.5 樣品測定

將上述已裝有樣品溶液和對照品溶液的液相小瓶放到液質(zhì)聯(lián)用儀中，各吸取1 μL注人液質(zhì)聯(lián)用儀，依據(jù)上述測定條件分別進(jìn)行加入分析。

2.1.6 結(jié)果判斷

2.1.6.1 定性判斷

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品進(jìn)行定性判斷，在同一試驗(yàn)條件下，供試品應(yīng)該呈現(xiàn)定量離子對和定性離子對的色譜峰，被檢測組分的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)組分的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致；樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子的相對豐度比與相對濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液離子對相對豐度比的偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的禁用組分[11]。

2.2 結(jié)果與討論

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將7種對照品進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，采用正離子監(jiān)測模式，得到各組分的透鏡電壓，各篩選出兩個(gè)響應(yīng)最佳的子離子及其相應(yīng)的最佳碰撞電壓(CE)，響應(yīng)最強(qiáng)的作為定量離子，次強(qiáng)為性。各化合物優(yōu)化結(jié)果見表3。

表3 各化合物優(yōu)化結(jié)果

圖1 (1)克霉唑母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)克霉唑碰撞電壓優(yōu)化圖，(3)克霉唑二級子離子質(zhì)譜圖

圖2 (1)萘替芬母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)萘替芬碰撞優(yōu)化圖，(3)萘替芬子離子質(zhì)譜圖

圖3 (1)氟康唑母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)氟康唑碰撞電壓優(yōu)化圖，(3)氟康唑子離子質(zhì)譜圖

圖4 (1)聯(lián)苯芐唑母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)聯(lián)苯芐唑碰撞電壓優(yōu)化圖，(3)聯(lián)苯芐唑子離子質(zhì)譜

圖5 (1)灰黃霉素母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)灰黃霉素碰撞電壓優(yōu)化圖，(3)灰黃霉素二級子離子質(zhì)譜圖。

圖6 (1)益康唑母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)益康唑碰撞電壓優(yōu)化圖，(3)益康唑二級子離子質(zhì)譜圖。

圖7 (1)咪康唑母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，(2)咪康唑碰撞電壓優(yōu)化圖，(3)咪康唑二級子離子掃譜圖

圖1～7為各對照品的母離子透鏡電壓優(yōu)化圖，碰撞電壓優(yōu)化圖和子離子質(zhì)譜圖。如圖所示，在該實(shí)驗(yàn)條件下，從圖中選出個(gè)組分響應(yīng)最佳的母離子透鏡電壓，兩個(gè)最佳響應(yīng)子離子及其最佳的碰撞電壓。

2.2.2 樣品測定結(jié)果

相應(yīng)對照品及樣品提取離子流圖見圖2、3，樣品提取離子流圖和對照品離子流圖中相同顏色的離子流代表同一物質(zhì)的檢測。(圖中從上往下序號：1克霉唑，2萘替芬，3氟康唑，4聯(lián)苯芐唑，5灰黃霉唑，6益康唑，7咪康唑)。7個(gè)組分分別在不同的通道進(jìn)行檢測，對單一特征離子對具有專一選擇性，不會(huì)產(chǎn)生互相干擾的結(jié)果；而該模式下所得到的二級離子質(zhì)譜圖具有的獨(dú)特性可以作為進(jìn)一步比對和驗(yàn)證的依據(jù)，從而增加了判斷被檢測樣品是否含非法添加的可靠性。

圖2 對照品提取離子流圖

圖3 樣品提取離子流圖

由圖2、3可知，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，被檢測的樣品的質(zhì)量色譜峰與對照品溶液中對應(yīng)組分的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致時(shí)未出現(xiàn)相同色譜峰，此外在多反應(yīng)離子監(jiān)測的模式下也未出現(xiàn)與對照品子離子質(zhì)譜圖(圖1～7(3))一致的離子對的響應(yīng)信號。進(jìn)一步確認(rèn)該批次化妝品中不含有禁用組分。由于多反應(yīng)監(jiān)測模式具有檢測速度快，掃描方式專屬性強(qiáng)，故在液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中常用于非法添加物的定性檢測[10-11]。

3 結(jié)論

本工作使用了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法快速檢測化妝品中禁用組分，耗時(shí)較短，操作簡便，可進(jìn)行化妝品檢驗(yàn)的批處理，大大提高了檢測效率，此外還具有較高靈敏度、較高精密度和高準(zhǔn)確率的特點(diǎn)。所以是一種非?？煽康胤治黾夹g(shù)。