寧楚潔，趙倩，謝春陽，林柯

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

目前我國玉米種植面積約2.3×107hm2，玉米須的年產量約為750 萬噸，資源相當豐富[1]。玉米須為禾本科玉蜀黍屬植物玉米的干燥花柱和柱頭[2]，富含黃酮、多糖、甾醇、皂苷以及微量元素等多種有效成分，具有抗痛風、抗疲勞、降血糖、降血脂、抗糖尿病、抗菌消炎、抗氧化等功效[3]。玉米須黃酮是玉米須的重要活性物質，具有很強的抗氧化活性[4-5]。

酵素是指水果或者蔬菜在多種有益菌的自然條件下發(fā)酵產出的含有豐富的酶、多種維生素、礦物質和次生代謝產物等功能成份的發(fā)酵飲品。酵素可以加速人體內生化反應，但不會改變生化反應的方向和生成產物的性質。

微生物酵素是以一種或者多種新鮮水果、蔬菜等為原料，經過多種有益菌發(fā)酵產生含有豐富酶、礦物質、維生素和次生代謝產物等功能性微生物發(fā)酵產品[6]，具有抗氧化、抗菌消炎、潤腸通便、增強機體免疫力、改善消化吸收等保健功能[7]。

當今，食用型酵素作為一種新型保健產品在日本已經被大眾所認同，形成相對較成熟的供應鏈及市場。我國部分企業(yè)也開始關注該類產品的功效和產值，已經進行了相關產品開發(fā)研究和產業(yè)建設[8-9]。

此外，果蔬酵素種類繁多，但添加植物提取物復合發(fā)酵的報道較少。因此，本試驗旨在以玉米須黃酮提取液和果蔬混合，采用葡萄酒酵母、乳酸菌和醋酸菌進行復合發(fā)酵[10]制備玉米須果蔬復合酵素，產品具有較強抗氧化性，為產品功能性研究的應用提供依據(jù)。同時，本研究增強了復合酵素飲料的功能性，可促進玉米須的加工利用，為今后果蔬酵素高端產品的開發(fā)提供理論依據(jù)，并推動中國酵素行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

西紅柿、蘋果、大豆和玉米須：市售。

1.1.2 菌種

安琪高活性葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（保加利亞乳桿菌）：北京川秀科技有限公司；醋酸菌：煙臺帝伯仕酵母有限公司。

1.1.3 試劑

MRS 固體培養(yǎng)基、MRS 液體培養(yǎng)基、白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；檸檬酸：河南萬邦實業(yè)有限公司；蘆?。航靼鄄菰瓷锟萍加邢薰荆豢箟难幔嚎ǘ懮藤Q有限公司；二苯代苦味酰基苯肼（DPPH）甲醇：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH：北京化工廠；以上均為分析純。

1.1.4 儀器與設備

HWS 恒溫培養(yǎng)箱：西安唯信檢測設備有限公司；SW-CJ 超凈工作臺：浙江蘇凈凈化設備有限公司；HQL150C 恒溫搖床：武漢中科科儀技術發(fā)展有限責任公司；DZTW 電熱恒溫水浴鍋：上海啟前電子科技有限公司；XFH-40CA 型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；752 型紫外光柵分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DR403 型酒精計：北京杰瑞恒達科技有限公司；PHS-3C 型酸度計：深圳市柯達電子有限公司；FW20TX 型糖度計：上海天壘儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 原料預處理

選擇個體均一、無機械損傷的蘋果和西紅柿清洗，切塊，用熱水預煮軟化后與少量浸泡后的黃豆打漿榨汁，得到果蔬原液備用。將玉米須烘干粉碎，稱量20 g 玉米須粉溶于800 mL 水，在70 ℃下提取3 h，過濾，得玉米須黃酮提取液[11]。

1.2.2.2 發(fā)酵基質制備

將一定量的玉米須提取液與處理好的果蔬原液進行混合，共同置于發(fā)酵瓶中。

1.2.2.3 接種和發(fā)酵

1）將酵母菌和乳酸菌以1 ∶1 的質量比進行混合，備用。在果蔬原液中接種該混合菌液，密閉置于恒溫箱中發(fā)酵一段時間后，再添加醋酸菌，搖床發(fā)酵。

2）單因素試驗

選取發(fā)酵時間 30、35、40、45、50 h，發(fā)酵溫度 26、28、30、32、34 ℃以及接種量 1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%為單因素，以總酸含量為指標進行單因素試驗。

3）Box-Behnken 試驗設計

經過單因素試驗，獲得各個因素的水平，選用該主要因素和總酸含量作為自變量與響應值，采用Box-Behnken 試驗方法，獲得響應面因素與水平表，對酵素發(fā)酵的條件進行優(yōu)化[12]。

4）調配

將發(fā)酵完成的酵素原液加入一定量的白砂糖和檸檬酸進行調配，以達到最佳的口感和風味。

1.2.3 果蔬酵素總酸的測定

可滴定酸按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》測得。

1.2.4 玉米須黃酮含量的測定

三氯化鋁法[13]測定濾液中黃酮含量。稱取0.010 g蘆丁標準品，用30%乙醇溶解并定容至100 mL 的容量瓶中，制成0.1 mg/mL 的蘆丁標準溶液。分別吸取剛配制好的蘆丁標液 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分別置于50 mL 的容量瓶中，依次編號0～5，用30%乙醇補至10 mL 后，加入0.8 mL 的5%的NaNO2溶液搖勻，靜置 6 min 后再加入 0.8 mL 10%的 Al（NO3）3搖勻，靜置 6 min，加入 10 mL1 mol/L 的 NaOH 溶液，搖勻15 min 后顯色，在510 nm 處測定吸光度，計算黃酮含量。

1.2.5 DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基清除能力被廣泛的應用在評估短時間內的抗氧化活性[14]。不同濃度下的DPPH 自由基清除能力按照添加黃酮提取物組與未添加黃酮提取物組，自然發(fā)酵組與接菌發(fā)酵組酵素所測定的結果進行對比[15]。

準確移取2 mL 濃度分別為10 %、30 %、50 %、70 %、90%的酵素樣品液于10 mL 的容量瓶中，再向容量瓶中加入2 mL 質量濃度為80%的DPPH 乙醇溶液，混合均勻后在21 ℃的條件下靜置30 min，以無水乙醇溶液作為空白對照，在517 nm 處測定樣品的吸光度，記為A1；將體積為2 mL 的DPPH 溶液和體積同為2 mL 的無水乙醇溶液充分混合均勻，測其吸光度，記為A0；將體積為2 mL 的酵素液與體積同為2 mL 的無水乙醇溶液充分混合，測定其吸光度，記為A2，根據(jù)方式計算DPPH 自由基清除率。

式中：A1為2 mL DPPH 乙醇水溶液和 2 mL 酵素樣品液的吸光度；A0為2 mL 酵素液與2 mL 無水乙醇混合溶液的吸光度[16]。

2 結果與分析

2.1 玉米須黃酮含量的試驗結果

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

如圖1 所示，蘆丁標準曲線的線性回歸方程為y=1.454 6x+0.017 3，相關系數(shù)為0.999 7，在0～0.5 mg/mL的范圍內符合Lambert-Beer 定律。用紫外測定玉米須黃酮在510 nm 處的吸光度，代入方程進行計算，可知玉米須提取液中黃酮含量為2.15%。

2.2 酵素發(fā)酵條件優(yōu)化的試驗結果

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 接種量的確定

在30 ℃下，發(fā)酵時間為40 h 的條件下進行接種量的單因素試驗見圖2。

圖2 接種量對酵素總酸含量的影響Fig.2 Effect of inoculum size on total acid content of enzyme

如圖2 所示，隨著接種量的增加，使得活菌基數(shù)增加，導致菌數(shù)快速增加，總酸含量呈上升趨勢，當接種量為2.0%時，達到最大，隨后開始緩慢下降。接種量太低，導致發(fā)酵緩慢，延長發(fā)酵時間；接種量太高，不僅總酸度變化不大，還增加成本。所以，綜上所述，選用2.0%作為最佳的接種量。

2.2.1.2 發(fā)酵時間的確定

接種2%的混合菌液，在30 ℃下進行發(fā)酵時間的單因素試驗見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對酵素總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid content of enzyme

如圖3 所示，隨著發(fā)酵時間的增加，酵素的總酸含量逐漸增加，當發(fā)酵時間為40 h 時，總酸含量達到最大值，隨后趨于平緩[17]，這是由于發(fā)酵初期菌種繁殖，并大量產酸，而發(fā)酵后期菌種沉積于底部，次級代謝產物大量積累，發(fā)酵變緩。因此，選用40 h 作為最佳的發(fā)酵時間。

2.2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

接種2%的混合菌液，在發(fā)酵時間為40 h 下進行發(fā)酵溫度的單因素試驗見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對酵素總酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on total acid content of enzyme

如圖4 所示，不同的發(fā)酵溫度下，活菌數(shù)和產酸量不同。隨著發(fā)酵溫度的增加，酵素的總酸含量逐漸增加，隨后趨于平緩。當發(fā)酵溫度為30 ℃時，總酸含量達到最大值，活菌數(shù)和總酸度達到最高，因此，選用30 ℃作為最佳的發(fā)酵溫度。

2.2.2 Box-Behnken 試驗設計結果

表1 為Box-Behnken 試驗設計因素及水平，根據(jù)酵素發(fā)酵的因素水平進行響應面優(yōu)化，共17 組試驗。

表1 酵素發(fā)酵條件Box-Behnken 試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

表2 酵素發(fā)酵條件Box-Behnken 設計方案及試驗結果Table 2 Design scheme experimental results of Box-Behnken

續(xù)表2 酵素發(fā)酵條件Box-Behnken 設計方案及試驗結果Continue table 2 Design scheme experimental results of Box-Behnken

2.2.3 二次回歸模型擬合及方差分析

利用Design Export 7.0 軟件，以接種量、發(fā)酵溫度、和發(fā)酵時間為自變量，以酵素總酸含量為響應值，對表2 中的試驗結果進行多元擬合，建立回歸模型：Y=4.15+0.096A+0.11B+0.077C-0.04AB-0.043AC-0.028BC-0.12A2-0.11B2-0.14C2

Box-Behnken 試驗方差分析見表3。

表3 Box-Behnken 試驗方差分析Table 3 Box-Behnken experimentation analysis of variance

如表3 所示，模型的顯著性P 值小于0.000 1，表明試驗設計有效；而失擬項 P=0.279 7＞0.05，說明模型與試驗值的差異較??；R2=0.993 1，表明試驗誤差較小；校正系數(shù)R2adj=0.984 1，表明98.41%的響應值變化都可以以這個模型來解釋?；谏厦娴脑囼灲Y果可以知道試驗條件設計合理有效。

根據(jù)表3 也可以看出，該模型的一次項A、B、C，交互項 AB、AC，二次項 A2，B2，C2的 P 值均小于 0.01，BC小于0.05，都達到了顯著的水平，說明上述幾項對酵素總酸含量均有顯著的影響。并得出在這3 個因素中，發(fā)酵時間是最顯著的變量，其次是接種量和發(fā)酵溫度。

2.2.4 響應面分析

各因素之間交互作用的響應面圖見圖5～圖7。

圖5 接種量與發(fā)酵時間對酵素總酸含量的影響Fig.5 Effect of inoculum size and fermentation time on total acid content of enzyme

圖6 接種量與發(fā)酵溫度對酵素總酸含量的影響Fig.6 Effect of inoculum size and fermentation temperature on total acid content of enzyme

圖7 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度對酵素總酸含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time and fermentation temperature on total acid content of enzyme

2.2.5 酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化和驗證

試驗條件加以驗證，當接種量為2.05%，提取溫度為41.31 h，發(fā)酵溫度為30.92 ℃，總酸含量最高，為4.18%。考慮到實際性以及儀器的限制性，將最佳試驗條件進行調整，即接種量為2%，發(fā)酵時間41 h，發(fā)酵溫度為31 ℃，進行3 組驗證試驗，此時總酸含量是2.02%。實測值與預測值非常相近，表明這個模型可以準確地分析酵素的發(fā)酵條件。

2.3 玉米須果蔬復合酵素飲料配方的調配結果

按照發(fā)酵條件制備獲得的玉米須果蔬復合發(fā)酵液用檸檬酸、白砂糖進行口感調配。在大量試驗的基礎上，通過全因子試驗[18]來確定檸檬酸和白砂糖的添加量，以感官評分為指標。評分標準見表4，全因子試驗水平表見表5，飲料調配全因子試驗結果見表6。

表4 發(fā)酵飲料的感官評分標準Table 4 Sensory scoring criteria for fermented beverages

表5 全因子試驗水平表Table 5 All factor test schedule horizontal table

表6 飲料調配全因子試驗結果Table 6 All-round distribution condition for beverage distribution results

從全因子試驗結果可知，當白砂糖添加量為4%，檸檬酸添加量為0.06%時，玉米須果蔬復合酵素飲料的感官評分最高。

2.4 DPPH自由基清除能力

不同濃度下的DPPH 自由基清除能力按對照組和試驗組酵素的測定結果繪制出變化曲線[19]見圖8。

由圖8 可知，對照組玉米須果蔬復合酵素飲料在樣品濃度低于30%時，DPPH 自由基清除率為23.56%，但試驗組酵素飲料的清除率為62.88%；當酵素濃度為50%時，對照組對DPPH 自由基的清除率為38.87%，試驗組對DPPH 自由基清除率高達86.24%，遠遠高于對照組。試驗結果表明，添加酵母菌、乳酸菌、醋酸菌的酵素飲料對DPPH 自由基有很強的清除能力。

圖8 玉米須果蔬復合酵素飲料對DPPH 自由基的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of corn silk and vegetable compound enzyme beverage on DPPH·

3 結論

本試驗結果表明，酵素發(fā)酵的最佳條件為：接種量2%，發(fā)酵時間41 h，發(fā)酵溫度31 ℃；得到的果蔬復合發(fā)酵液用4%的白砂糖，0.06%的檸檬酸進行調配，在該條件下玉米須果蔬酵素飲料的感官評分最高；同時可以發(fā)現(xiàn)，玉米須果蔬復合酵素飲料對DPPH 自由基具有較強的清除作用。本試驗研究開發(fā)了一種新型功能性酵素飲料，為飲料產業(yè)提供了一定的理論依據(jù)。