左婧馳，陳云，郭馨陽(yáng)，桂琳，任天星，陳靜，卯玉嶸，袁發(fā)滸

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056）

我國(guó)飲酒文化自古有之，因過(guò)度飲酒引發(fā)的疾病問(wèn)題也伴隨而來(lái)，節(jié)假日期間急性酒精中毒案例更是屢見(jiàn)不鮮。急性酒精中毒往往導(dǎo)致患者胃腸道粘膜潰爛出血，加重肝臟代謝解毒負(fù)擔(dān)，親脂性乙醇甚至?xí)鹉X組織氧化損傷，危害極大[1-2]。因而，開(kāi)發(fā)高效安全的抗醉解酒產(chǎn)品具有重要意義。

桃膠多糖（peach gum polysaccharide，PGP）是近年來(lái)被廣泛研究的一種天然來(lái)源多糖，其主要由阿拉伯糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等以β-糖苷鍵聚合而成[3]。以往研究表明PGP 具有良好的吸濕保濕性，同時(shí)具有良好的黏度和成膜性，具備良好的工業(yè)加工屬性[4-6]，此外，PGP 還具有降血糖、提高免疫力、改善腸道菌群等諸多優(yōu)良生物學(xué)特性，是保健食品開(kāi)發(fā)的重要資源[7-10]。目前，尚未見(jiàn)將PGP 應(yīng)用于抗醉解酒方面的研究、開(kāi)發(fā)。本研究通過(guò)體外、體內(nèi)試驗(yàn)觀察PGP 抑制乙醇析出、保護(hù)胃腸道粘膜作用，同時(shí)進(jìn)一步研究PGP 與天然抗氧化劑表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）協(xié)同的抗醉解酒作用，并對(duì)其生物學(xué)機(jī)制做分析探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原桃膠（食品級(jí)）：香港位元堂藥廠有限公司；食用酒精（95%，食品級(jí)）：河南榮騰食品配料有限公司；透析袋（3 500 D）：北京索萊寶科技有限公司；乙醇檢測(cè)分析試劑盒：美國(guó)BioVision 公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）測(cè)試盒、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）測(cè)定試劑盒、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）活性測(cè)試盒：南京建成頂浩生物制技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量22 g～25 g：湖北省疾病預(yù)防控制中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。小鼠飼養(yǎng)于溫度23 ℃～25 ℃、濕度40%～60%的SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均于江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)經(jīng)江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平（ME204E）：瑞士梅特勒-托利多；電熱恒溫水浴鍋（HH.S）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（SP-Max 2300A2）：上海閃譜生物科技有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H1650R）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Evolution 300）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 PGP 對(duì)乙醇滲出的影響

以原桃膠為原料，采用徐燕等[3]所述方法提取制備桃膠多糖，即依次經(jīng)熱水浸提、乙醇沉淀、Sevage 去蛋白等工序后提取分離得到桃膠多糖。

以超純水溶解，分別配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%桃膠多糖溶液。用透析袋夾將透析袋一端夾住，加入10 mL 人工胃液，然后分別加入不同濃度的桃膠多糖溶液和生理鹽水，將其放入裝有250 mL 生理鹽水的廣口瓶中，0.5 h 后加入5 mL 食用乙醇于透析袋內(nèi)，隨即夾閉透析袋另外一端，將透析袋完全浸入廣口瓶?jī)?nèi)生理鹽水中，用parafilm 封口膜封住瓶口，置于37 ℃培養(yǎng)箱中。采用劉佳[11]所述重鉻酸鉀酸性還原法，分別于試驗(yàn)起始點(diǎn) 0、5、10、15、20、30、40、50、60、90 min 測(cè)定透析袋外溶液的乙醇濃度，以610 nm 處吸光度表示。

1.4.2 PGP 對(duì)急性酒精中毒小鼠的解酒作用

將雄性昆明小鼠分為6 組，每組8 只，試驗(yàn)開(kāi)始前8 h 禁水禁食，以0.5 mL/25 g 劑量分別給予生理鹽水0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%PGP 灌胃，0.5 h 后，再以0.4 mL/25 g 分別給予60%食用乙醇灌胃制備急性酒精中毒模型。試驗(yàn)開(kāi)始后，記錄小鼠翻正反射消失的時(shí)間為小鼠醉酒潛伏期時(shí)長(zhǎng)，翻正反射消失至小鼠翻正反射再次恢復(fù)的時(shí)長(zhǎng)為醉酒睡眠時(shí)間。

1.4.3 PGP 協(xié)同EGCG 對(duì)急性酒精中毒小鼠的血清乙醇含量的影響

與單獨(dú)使用PGP 觀察對(duì)小鼠急性酒精中毒模型試驗(yàn)操作類似，分別設(shè)空白對(duì)照組、模型組、2%PGP預(yù)處理組、2 % PGP+100 mg/kg EGCG 預(yù)處理組、2 %PGP+200 mg/kg EGCG 預(yù)處理組、2 % PGP+400 mg/kg EGCG 預(yù)處理組，每組15 只小鼠，除對(duì)照組外以等體積生理鹽水灌胃外，其余各組在干預(yù)后0.5 h 后均0.4 mL/25 g 分別給予60%食用乙醇灌胃，分別于乙醇灌胃后0.5、1.0、1.5、2.0 h 采集小鼠眼眶靜脈血，分離血清，按BioVision 乙醇檢測(cè)試劑盒操作指南檢測(cè)血清乙醇含量。

1.4.4 PGP 協(xié)同EGCG 對(duì)急性酒精中毒小鼠的肝組織、胃組織生化指標(biāo)的影響

小鼠于乙醇灌胃2.5 h 后，采用頸椎脫臼法處死，解剖小鼠，分離出胃及肝臟，縱向剖開(kāi)小鼠胃，生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，觀察小鼠胃腸粘膜損傷情況。按生化檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明分別檢測(cè)胃組織MDA 含量、NO 含量、PGE2 含量、SOD 活力及肝組織 ADH 活力、ALDH 活力。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用graphpad prism 6.0 軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGP濃度依賴性抑制體外乙醇滲出速率

以透析袋法體外模擬乙醇吸收試驗(yàn)，分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的PGP 溶液預(yù)處理，與生理鹽水對(duì)照相比，各濃度PGP 預(yù)處理后，乙醇析出速率如圖1所示（以重鉻酸鉀酸性還原反應(yīng)液OD610nm表示[12]）。

圖1 不同濃度PGP 對(duì)體外模擬乙醇吸收的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PGP on simulated ethanol absorption in vitro

由圖1 可知乙醇析出速率均下降，且隨著PGP 濃度的增加，乙醇析出速度越慢。同時(shí)，可見(jiàn)空白對(duì)照組在試驗(yàn)開(kāi)始后乙醇析出線性增加，60 min 后乙醇析出基本完全，而PGP 處理后，乙醇析出速率僅于試驗(yàn)開(kāi)始30 min 內(nèi)呈現(xiàn)線性快速析出，而后析出速度明顯減緩，且隨著PGP 濃度的增加，最終析出的乙醇總量相應(yīng)減少。表明PGP 具有吸附乙醇分子，減緩乙醇滲出的作用。

2.2 PGP延長(zhǎng)小鼠醉酒潛伏期、縮短醉酒后睡眠時(shí)長(zhǎng)

不同濃度PGP 對(duì)小鼠醉酒潛伏期及酒后睡眠時(shí)長(zhǎng)的影響如圖2 所示。

圖2 不同濃度PGP 對(duì)小鼠醉酒潛伏期及酒后睡眠時(shí)長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PGP on drunken latency and sleep length in mice

小鼠經(jīng)60%食用乙醇灌胃造模后，隨著灌胃PGP濃度的增加，可見(jiàn)小鼠醉酒潛伏期隨之延長(zhǎng)（圖2A），濃度為1.5 %、2.0 %的PGP 處理組分別較空白對(duì)照（0 %PGP）的醉酒潛伏期時(shí)長(zhǎng)顯著提高（P<0.01，P<0.001）。

醉酒后睡眠時(shí)間對(duì)比如圖2B 所示，可見(jiàn)1 %、1.5 %及2%的PGP 灌胃預(yù)處理后的小鼠均較空白對(duì)照小鼠的睡眠時(shí)間縮短且差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），隨著PGP 濃度的升高，相應(yīng)的睡眠時(shí)間逐漸縮短。

2.3 PGP協(xié)同EGCG顯著降低醉酒小鼠血清乙醇濃度

動(dòng)態(tài)追蹤PGP 與EGCG 協(xié)同作用對(duì)醉酒小鼠血清中乙醇濃度的變化，如表1 所示。

小鼠血清乙醇濃度在灌胃酒精后，血清乙醇濃度先逐漸升高后下降。在2%PGP 單獨(dú)干預(yù)及2%PGP加不同濃度的EGCG 干預(yù)后，在監(jiān)測(cè)的0.5、1.0、1.5、2.0 h 這4 個(gè)節(jié)點(diǎn)，均分別較模型組小鼠的血清乙醇濃度下降，且隨著EGCG 濃度的增加，血清乙醇濃度降幅相應(yīng)增加。

表1 PGP 與EGCG 對(duì)醉酒小鼠血清乙醇濃度變化的影響Table 1 Effects of PGP and EGCG on serum alcohol concentration in drunken mice

2.4 PGP協(xié)同EGCG顯著緩解急性乙醇性胃粘膜損傷

解剖小鼠后，分離出小鼠胃，剖開(kāi)后清洗去除胃內(nèi)容物后，小鼠胃粘膜組織形態(tài)如圖3 所示。

由圖3 可知，模型組小鼠胃粘膜組織整體充血紅脹，并有多處出血點(diǎn)及少量糜爛（圖3B）；2%PGP 預(yù)處理組小鼠胃粘膜組織充血顯著減輕，可見(jiàn)局部、分散的血管充盈紅脹（圖3C）；2 % PGP 與不同濃度EGCG 共同處理后，小鼠胃粘膜組織充血情況顯著改善，且隨著EGCG 濃度的增加，胃粘膜組織出血點(diǎn)隨之減少，2%PGP+400 mg/kg EGCG 處理組小鼠胃粘膜外觀與空白對(duì)照組接近，偶見(jiàn)零星點(diǎn)狀充血（圖3D～F）。

圖3 PGP 協(xié)同EGCG 對(duì)小鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of PGP combined with EGCG on gastric mucosal injury in mice

為進(jìn)一步深入分析PGP 與EGCG 對(duì)乙醇性小鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用[13-15]，檢測(cè)了胃組織的氧化損傷指標(biāo)MDA 含量及SOD 活力，如表2 所示。

模型組小鼠胃組織MDA 含量較空白對(duì)照組顯著增加、SOD 活力顯著下降，呈現(xiàn)明顯地氧化性損傷。而PGP 干預(yù)后，氧化損傷指標(biāo)得到明顯逆轉(zhuǎn)，且隨著EGCG 濃度的升高，逆轉(zhuǎn)程度相應(yīng)升高。

一氧化氮（NO）是胃組織重要的保護(hù)因子，胃粘膜損傷后NO 的合成增加并可抑制胃酸分泌，有利于胃粘膜損傷后的修復(fù)過(guò)程[14，16-18]。如表2 所示，小鼠灌胃后NO 水平顯著下降，經(jīng)PGP 或PGP 與不同濃度的EGCG 預(yù)處理后的小鼠NO 水平較模型組有顯著逆轉(zhuǎn)，且PGP 與EGCG 協(xié)同干預(yù)后，NO 水平較單獨(dú)使用PGP 的小鼠上升幅度增加（P<0.05）。同樣地，另一種胃組織保護(hù)因子，前列腺素E2（PGE2）[18-19]與呈現(xiàn)出與NO 一樣的變化趨勢(shì)，PGP 及EGCG 可顯著抑制因大劑量乙醇對(duì)胃組織損傷導(dǎo)致的PGE2 含量的損失。

2.5 PGP協(xié)同EGCG提高醉酒小鼠肝臟乙醇代謝酶活

肝臟是機(jī)體代謝乙醇最主要的器官（大于90 %），乙醇在肝內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶（ADH）催化后轉(zhuǎn)化為乙醛，再由乙醛脫氫酶（ALDH）催化轉(zhuǎn)為乙酸，而后進(jìn)一步分解并最終轉(zhuǎn)為二氧化碳和水。其中ADH 和ALDH是乙醇代謝最為關(guān)鍵的酶[20-22]，表3 所示為各組小鼠ADH、ALDH 活力變化情況。

由表3 可知，經(jīng)PGP 預(yù)處理后，小鼠肝臟ADH活力較模型組（6.78±0.51）U/mg pro 顯著增加（7.38±0.63）U/mg pro，P<0.05，且 EGCG 分別與 100、200、400 mg/kg EGCG 聯(lián)用后，ADH 活力均較單獨(dú)使用2%PGP 組小鼠升高，且2%PGP+400 mg/kg EGCG 組較單獨(dú)2 % PGP 組具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異（P＜0.01）。與ADH 變化趨勢(shì)一致，2%PGP 亦可增加小鼠ALDH 活力（504.45±30.31）U/mg pro，且 PGP 與不同濃度的EGCG 聯(lián)用后一樣地較單獨(dú)使用PGP 具有更高的ALDH 水平，呈劑量依賴性增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 PGP 與EGCG 對(duì)醉酒小鼠肝組織ADH 及ALDH 活力變化的影響Table 3 Effects of PGP and EGCG on ADH and ALDH activities in liver tissue of drinking mice

3 結(jié)論

本研究分別從體外試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了桃膠多糖可吸附乙醇分子，抑制乙醇吸收入血，顯著延長(zhǎng)急性醉酒小鼠的醉酒潛伏期，縮短小鼠醉酒后睡眠時(shí)間，具有良好的抗醉、解酒方面的應(yīng)用前景。此外，系統(tǒng)分析了桃膠多糖與天然抗氧化劑EGCG 聯(lián)用后對(duì)小鼠醉酒的影響，結(jié)果表明，桃膠多糖與EGCG 聯(lián)用可顯著增強(qiáng)桃膠多糖的抗醉、解酒方面的作用，其內(nèi)在機(jī)制包括：顯著減少乙醇所致胃組織氧化性損傷、增強(qiáng)胃組織清除氧自由基能力；增強(qiáng)胃黏膜屏障防御作用；提升肝內(nèi)乙醇代謝酶系的活力，促進(jìn)乙醇分解代謝。